1. Pasażowanie i hodowla komórek TUM622 w hodowlach 2D
- Ciepła pożywka hodowlana 3D i odczynniki do dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) dla komórek TUM622 w temperaturze 37 °C.
- Pasaż komórek TUM622 przy 80% zbiegu w kolbach 2D. Zwykle dzieje się to 1 tydzień po pasażu.
- Wyrzucić starą pożywkę z kolby T75 i przemyć raz 6 ml buforu HEPES. Należy unikać pipetowania bezpośrednio na komórki.
- Odessać bufor HEPES. Dodaj 4 ml trypsyny/EDTA (0,25 mg/ml, patrz tabela materiałów) w celu szybkiego spłukania i wyrzuć trypsynę/EDTA.
- Dodać 2 ml trypsyny/EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Wyjąć kolby z inkubatora i postukać w kolby, aby poluzować komórki bez tworzenia pęcherzyków powietrza, a następnie zwrócić kolby do inkubatora na dodatkowe 5 minut
nuta: Długotrwała ekspozycja na trypsynę nieodwracalnie uszkodzi komórki i zmieni ich fenotyp, dlatego zaleca się ograniczenie czasu ekspozycji komórek na trypsynę.
- Upewnij się, że komórki odłączyły się i zdysocjowały pod mikroskopem świetlnym (4x lub 10x). Dodać 4 ml buforu neutralizacyjnego (bufor TNS) (patrz informacje o odczynniku do subkultur w Tabeli materiałów), a następnie 10 ml pożywki 3D (patrz Tabela materiałów).
- Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby jeszcze bardziej zdysocjować komórki za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Przenieść zawiesinę przez sitko o pojemności 40 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
- Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
- Nasiona 0,8 x 106 komórek/kolba T75 w 20 ml pożywki hodowlanej 3D (patrz tabela materiałów).
- Karm komórki co drugi dzień, zastępując połowę zużytej pożywki świeżą pożywką.
2. Posiewanie komórek TUM622 w macierzy zewnątrzkomórkowej do hodowli 3D
- Dzień przed eksperymentem rozmrozić fiolki z matrycą błony podstawnej w lodówce o temperaturze 4 °C przez noc. Plastikowe pipety (2 ml) i końcówki schłodzić w temperaturze -20 °C przez noc.
nuta: Nie wszystkie partie macierzy błony podstawnej mają taką samą zdolność do wspierania wzrostu 3D komórek TUM622. Dlatego konieczne jest nabycie i przetestowanie wielu partii macierzy błony podstawnej w celu zidentyfikowania tych, które wspierają silne tworzenie acini. Zwykle wymaga to wyższego stężenia białka (16-18 mg/ml) w matrycy.
- W dniu eksperymentu w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C należy umieścić ciepłą pożywkę hodowlaną 3D, bufor HEPES, trypsynę/EDTA i bufor neutralizujący trypsynę (TNS). Bezpośrednio przed założeniem kultury wyjmij rozmrożoną matrycę błony podstawnej z lodówki i umieść fiolkę na lodzie.
- Schłodzić płytki do hodowli tkankowych na metalowej platformie chłodzącej umieszczonej na lodzie. Umieść probówki wirówkowe na metalowym stojaku chłodzącym na lodzie.
- Korzystając z komórek TUM622 uzyskanych w kroku 1.7, oblicz żądaną liczbę komórek potrzebnych do posiewu. Zazwyczaj potrzeba 15 000-30 0000 komórek na dołek 24-dołkowej płytki. Niższa gęstość jest bardziej odpowiednia do obrazowania i kwantyfikacji, podczas gdy wyższa gęstość jest preferowana podczas pobierania komórek do ekstrakcji RNA lub western blot.
- Przenieść zawiesinę komórek do schłodzonej probówki wirówkowej (każda probówka zawiera komórki do trzykrotnego posiania) i odwirować w temperaturze 300 x g w wirówce kubełkowej do zawieszania w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
- Ostrożnie odessać supernatant pipetą zasysającą przymocowaną do niefiltrowanej końcówki (20 μl), pozostawiając około 100 μl pożywki w probówce (jako wskazówkę należy użyć oznaczeń na probówce).
- Delikatnie postukaj w bok rurki, aby usunąć i oddzielić granulkę przed powrotem do stojaka chłodzącego.
- Używając wstępnie schłodzonych pipet o pojemności 2 ml, delikatnie wymieszaj matrycę, pipetując kilka razy w górę i w dół, utrzymując fiolkę w kontakcie z lodem. Pipetować z równą i umiarkowaną prędkością, aby podczas tej procedury do matrycy nie zostały wprowadzone pęcherzyki.
- Przenieść odpowiednią objętość matrycy do każdej probówki wirówkowej. W przypadku posiewu trzykrotnego na płytce 24-dołkowej dodaj 1,1 ml macierzy membrany podstawnej do każdej probówki.
- Używając wstępnie schłodzonych końcówek, odpipetuj matrycę w każdej probówce w górę i w dół około 10 razy, aby uzyskać jednolitą zawiesinę komórek.
- Przenieść 310 μl zawiesiny komórek/matryc do każdego dołka wstępnie schłodzonej płytki 24-dołkowej. Pipetę umieszcza się pod kątem 90° do powierzchni płytki, a zawiesinę dodaje się do środka studzienki. Zawieszenie powinno się rozłożyć i przykryć całą studnię bez konieczności przechylania płyty.
- Aby ułatwić dalszą analizę immunofluorescencyjną, umieść zawiesinę komórki/matrycy równolegle w szkiełkach z 2-dołkową komorą. Przenieść 100 μl zawiesiny komórek/matryc do środka studzienki z 2-dołkowym szkiełkiem komorowym (patrz Tabela materiałów). Dzięki temu matryca może tworzyć strukturę przypominającą kopułę o znacznie mniejszej objętości.
- Włożyć płytkę i komorę z powrotem do inkubatora do hodowli tkankowych i inkubować przez 30 minut, aby umożliwić zestalenie się matrycy. Zbadaj płytkę/szkiełko pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że pojedyncze komórki są równomiernie rozmieszczone w matrycy (4x lub 10x).
- Dodaj 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki 3D do każdego dołka i 1,5 ml pożywki 3D do każdego dołka szkiełka komorowego, a następnie włóż je z powrotem do inkubatora.
