Test ekstrakcji RNA: metoda ekstrakcji RNA z transfekowanych komórek raka płuc miRNA

Streszczenie

Źródło: Hossian, A. K. M. N. et al., Analiza kombinatorycznych zabiegów miRNA w celu regulacji cyklu komórkowego i angiogenezy. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film opisuje protokół ekstrakcji RNA z transfekowanych komórek raka płuc transfekowanych miRNA. Podejście to można wykorzystać do identyfikacji skojarzonej aktywności leczenia miRNA w zatrzymywaniu cyklu komórkowego i angiogenezie.

Protokół

1. transfekcja miR-143 i miR-506

UWAGA: Używaj rękawiczek lateksowych, okularów ochronnych i fartucha laboratoryjnego podczas wykonywania opisanych eksperymentów. W razie potrzeby należy używać komory bezpieczeństwa biologicznego z włączonym wentylatorem szafy, nie blokując dróg oddechowych ani nie zakłócając laminarnego przepływu powietrza. Zawsze ustawiaj szybę ochronną na odpowiedniej wysokości, zgodnie z opisem producenta.

1. Nasiona komórek NSCLC A549 w kolbie T25 cm2/płytce 6/96 dołków w pożywce DMEM/F12K uzupełnionej 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny (pożywka hodowlana) w kapturze do hodowli tkankowej i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ w inkubatorze do hodowli tkankowych.
2. Zawiesić miR-143 i/lub miR-506 naśladowcy lub zamieszać siRNA ze środkiem transfekcyjnym (2,4 μg miR zmieszano z 14 μl środka transfekcyjnego; patrz tabela materiałów) w 500 μl pożywki do transfekcji i 1,5 ml surowicy i pożywki DMEM/F12K wolnej od antybiotyków przy końcowym stężeniu miRNA 100 nM. Ilość miRNA może wymagać optymalizacji na różnych komórkach i stężeniach. Odpowiednie podejścia obejmują transfekcję komórek o rosnącym stężeniu miRNA (tj. 50-200 nM) oraz ocenę regulacji w dół ekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania.
3. Wyjąć pożywkę hodowlaną z kolby/płytki i przemyć raz 1x PBS.
4. Dodać kompleksy miRNA/czynnika transfekcyjno-mieszającego i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 6 godzin (wielkość kolby określa dodaną objętość inkubacji).
5. Zastąp pożywkę 4 ml pożywką hodowlaną i inkubuj komórki przez 24 godziny i/lub 48 godzin.
6. Zebrać transfekowane komórki przez trypsynizację, dodając 1 ml trypsyny-EDTA do każdej kolby T25 cm², inkubować przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C i dodać 3 ml pożywki hodowlanej w celu zebrania komórek. Umieścić zawartość każdej kolby w oddzielnej, oznaczonej probówce o pojemności 15 ml. Praca w kapturze do hodowli tkankowej.
7. Wirować przy 751 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
   nuta: Należy zachować ostrożność podczas usuwania supernatantu, ponieważ mieszanie probówki może spowodować utratę komórek.
8. Dodaj 2 ml 1x PBS i wiruj przez 5 minut przy 751 x g.
9. Powtórz kroki 7 i 8 raz, aby usunąć wszelkie ślady podłoża i supernatantu.
   nuta: Na tym etapie probówki z próbkami mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C lub mogą być natychmiast użyte.

2. Ekstrakcja RNA

1. Oczyść obszar roboczy, spryskując 70% alkoholem izopropylowym i roztworem do odkażania RNAzy.
2. Ekstrakcję RNA należy przeprowadzić przy użyciu odpowiedniego zestawu RNA (patrz Tabela materiałów).
3. Usunąć probówki z temperatury -80 °C i pozostawić do rozmrożenia. Dodaj 300 μl buforu do lizy i pipetuj w górę iw dół, aby przerwać błonę komórkową.
4. Dodaj równą objętość 100% ultraczystego etanolu.
5. Dobrze wymieszaj i umieść w kolumnie oddzielającej.
6. Wirować od 11 do 16 x g przez 30 s i usunąć przepływ.
7. Dodać 400 μl buforu płuczącego i odwirować w celu usunięcia buforu.
8. Dodać 5 μl DNAzy I z 75 μl buforu do trawienia DNA do każdej próbki i inkubować przez 15 minut.
9. Przepłukać próbkę 400 μl buforu przygotowawczego RNA.
10. Przemyć 2x buforem do przemywania RNA.
11. Dodaj wodę wolną od nukleaz do kolumny, odwiruj, a następnie zbierz RNA.
12. Zmierz całkowite stężenie RNA za pomocą spektrofotometru UV.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
A549 Komórki niedrobnokomórkowego raka płuc	Kontroler ATCC (Kontroler T	ATCC CCL-185
Tłumik Ambion Kontrola negatywna nr 1 siRNA	Ambion	Zobacz materiał AM4611
has-miR-143-3p mimik miRNA	Abm	MCH01315
has-miR-506-3p mimik miRNA	Abm	MCH02824
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Fisher Naukowy	10438026
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem hyklonu (PBS)	Fisher Naukowy	SH30256FS
DMEM 4,5 g/L glukozy, bez pirogronianu sodu, z L-glutaminą	Firma VWR	VWRL0100-0500
Invitrogen UltraPure Woda destylowana wolna od DNaz/ RNaz	Invitrogen	10-977-015
Zestawy Quick-RNA	Badania Zymo	Czynnik R1055
Etanol, absolutny (200 dowodów), klasa biologii molekularnej,	Odczynniki biologiczne Fisher	BP2818500
-80 °C Zamrażarka	Firma VWR	VWR40086A
Kropla nano	Thermo Scientific	NanoDrop jeden C
Płytka 96-dołkowa	CELLTREAT Naukowy	50-607-511
Penicylina-streptomycyna 10/10	Antlanta Biologicals	Zobacz materiał B21210
Inkubator CO2	Thermo Scientific	HERAcell 150i
DNAZA	Badania Zymo	E1010
Mieszanka odżywcza F-12K (Kaighn's Mod.) z L-glutaminą, Corning	Corning	45000-354
Płodowa surowica bydlęca - Premium	Antlanta Biologicals	S11150
Matchine wirówka z kontrolowaną temperaturą	Thermo Scientific	Zobacz materiał ST16R
Mikrowirówka matchine z kontrolowaną temperaturą	Eppendrof	Zobacz materiał 5415R

powiedział: powiedział: