1. transfekcja miR-143 i miR-506
UWAGA: Używaj rękawiczek lateksowych, okularów ochronnych i fartucha laboratoryjnego podczas wykonywania opisanych eksperymentów. W razie potrzeby należy używać komory bezpieczeństwa biologicznego z włączonym wentylatorem szafy, nie blokując dróg oddechowych ani nie zakłócając laminarnego przepływu powietrza. Zawsze ustawiaj szybę ochronną na odpowiedniej wysokości, zgodnie z opisem producenta.
- Nasiona komórek NSCLC A549 w kolbie T25 cm2/płytce 6/96 dołków w pożywce DMEM/F12K uzupełnionej 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny (pożywka hodowlana) w kapturze do hodowli tkankowej i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w inkubatorze do hodowli tkankowych.
- Zawiesić miR-143 i/lub miR-506 naśladowcy lub zamieszać siRNA ze środkiem transfekcyjnym (2,4 μg miR zmieszano z 14 μl środka transfekcyjnego; patrz tabela materiałów) w 500 μl pożywki do transfekcji i 1,5 ml surowicy i pożywki DMEM/F12K wolnej od antybiotyków przy końcowym stężeniu miRNA 100 nM. Ilość miRNA może wymagać optymalizacji na różnych komórkach i stężeniach. Odpowiednie podejścia obejmują transfekcję komórek o rosnącym stężeniu miRNA (tj. 50-200 nM) oraz ocenę regulacji w dół ekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania.
- Wyjąć pożywkę hodowlaną z kolby/płytki i przemyć raz 1x PBS.
- Dodać kompleksy miRNA/czynnika transfekcyjno-mieszającego i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 6 godzin (wielkość kolby określa dodaną objętość inkubacji).
- Zastąp pożywkę 4 ml pożywką hodowlaną i inkubuj komórki przez 24 godziny i/lub 48 godzin.
- Zebrać transfekowane komórki przez trypsynizację, dodając 1 ml trypsyny-EDTA do każdej kolby T25 cm2, inkubować przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C i dodać 3 ml pożywki hodowlanej w celu zebrania komórek. Umieścić zawartość każdej kolby w oddzielnej, oznaczonej probówce o pojemności 15 ml. Praca w kapturze do hodowli tkankowej.
- Wirować przy 751 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
nuta: Należy zachować ostrożność podczas usuwania supernatantu, ponieważ mieszanie probówki może spowodować utratę komórek.
- Dodaj 2 ml 1x PBS i wiruj przez 5 minut przy 751 x g.
- Powtórz kroki 7 i 8 raz, aby usunąć wszelkie ślady podłoża i supernatantu.
UWAGA: Na tym etapie probówki z próbkami mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C lub mogą być natychmiast zużyte.
2. Analiza cyklu komórkowego
- Wysiać 5 x 105 komórek dla każdej próbki w kolbie T25 cm2 i przeprowadzić transfekcję zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 1, kroki 1-5.
- Po 24 godzinach i 48 godzinach zbierz komórki przez trypsynizację.
- Przenieś zawiesiny komórek do sterylnych probówek o pojemności 15 ml i odpowiednio je oznacz.
- Odwirować próbki o masie 751 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
- Dodać 2 ml lodowatego 1x PBS, wirować i wirować w temperaturze 751 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant.
- Powtórz etap mycia z 1x PBS, aby usunąć resztki mediów.
- Ponownie zawiesić i rozbić osad, dodając 200 μl lodowatego 1x PBS przez pipetowanie.
- Napraw komórki, dodając kroplami 2 ml 70% lodowatego etanolu do probówki, delikatnie wirując.
- Inkubować probówki przez 30 minut w temperaturze pokojowej i umieszczać probówki w temperaturze 4 °C na 1 godzinę.
- Wyjąć probówki z 4 °C i odwirować przy 751 x g przez 5 minut.
- Dodać 2 ml lodowatego 1x PBS, wirować i wirować w temperaturze 751 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant.
- Dodać 500 μL 1x PBS z jodkiem propidyny (50 μg/ml) i rybonukleazą A (200 μg/ml).
- Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc próbki przed światłem.
- Pozyskaj dane z cytometru przepływowego. Użyj rozproszenia do przodu i z boku (FSC vs. SSC), aby wybrać główną populację komórek, z wyłączeniem zanieczyszczeń w lewym dolnym rogu wykresu gęstości FSC i SSC oraz klastrów komórek od góry do prawego górnego rogu wykresu gęstości FSC i SSC.
- Analizuj dane w celu identyfikacji populacji komórek na poszczególnych etapach cyklu komórkowego za pomocą odpowiedniego oprogramowania.