$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. transfekcja miR-143 i miR-506
UWAGA: Używaj rękawiczek lateksowych, okularów ochronnych i fartucha laboratoryjnego podczas wykonywania opisanych eksperymentów. W razie potrzeby należy używać komory bezpieczeństwa biologicznego z włączonym wentylatorem szafy, nie blokując dróg oddechowych ani nie zakłócając laminarnego przepływu powietrza. Zawsze ustawiaj szybę ochronną na odpowiedniej wysokości, zgodnie z opisem producenta.
- Nasiona komórek NSCLC A549 w kolbie T25 cm2/płytce 6/96 dołków w pożywce DMEM/F12K uzupełnionej 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny (pożywka hodowlana) w kapturze do hodowli tkankowej i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w inkubatorze do hodowli tkankowych.
- Zawiesić miR-143 i/lub miR-506 naśladowcy lub zamieszać siRNA ze środkiem transfekcyjnym (2,4 μg miR zmieszano z 14 μl środka transfekcyjnego; patrz tabela materiałów) w 500 μl pożywki do transfekcji i 1,5 ml surowicy i pożywki DMEM/F12K wolnej od antybiotyków przy końcowym stężeniu miRNA 100 nM. Ilość miRNA może wymagać optymalizacji na różnych komórkach i stężeniach. Odpowiednie podejścia obejmują transfekcję komórek o rosnącym stężeniu miRNA (tj. 50-200 nM) oraz ocenę regulacji w dół ekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania.
- Wyjąć pożywkę hodowlaną z kolby/płytki i przemyć raz 1x PBS.
- Dodać kompleksy miRNA/czynnika transfekcyjno-mieszającego i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 6 godzin (wielkość kolby określa dodaną objętość inkubacji).
- Zastąp pożywkę 4 ml pożywką hodowlaną i inkubuj komórki przez 24 godziny i/lub 48 godzin.
2. Ekspresja białka za pomocą mikromacierzy cyklu komórkowego przeciwciała
- Wysiewać 5 x 105 komórek dla każdej próbki w kolbach T25 cm2 i przeprowadzić transfekcję zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 1, kroki 1-5.
- Po 24 godzinach i 48 godzinach zbierz komórki przez trypsynizację.
- Przenieś zawiesiny komórek do probówek o pojemności 15 ml i odpowiednio je oznacz.
- Odwirować przy 751 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
- Dodać 2 ml lodowatego 1x PBS, wirować i wirować w temperaturze 751 x g przez 5 min. Wyrzucić supernatant.
- Powtórz etap prania z 1x PBS.
- Dodać 150 μl buforu do lizy uzupełnionego inhibitorami proteazy. Delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby przerwać błony komórkowe.
- Aby zapobiec wszelkim zakłóceniom buforu do lizy, należy przeprowadzić wymianę buforu w celu zastąpienia buforu do lizy buforem etykietującym, korzystając z kolumn do wymiany rozpuszczalników producenta.
- Określ ilościowo całkowite białko za pomocą testu BCA.
- Pobrać 70 μg próbki białka i dodać bufor do znakowania, aby uzyskać końcową objętość 75 μl.
- Dodać 100 μl dimetyloformamidu (DMF) do 1 mg odczynnika biotyny (biotyna/DMF).
- Dodać 3 μl biotyny/DMF do każdej próbki białka (biotynylowanej próbki białka) i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
- Dodać 35 μl odczynnika stop i wymieszać przez wirowanie.
- Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
- Przed użyciem wyjmij szkiełka z mikromacierzy z lodówki, aby ogrzały się do temperatury pokojowej przez 1 godzinę.
- Przeprowadzić blokowanie niespecyficznego wiązania poprzez inkubację szkiełek z 3% roztworem mleka w proszku (w odczynniku blokującym dostarczonym przez producenta) na szalce Petriego z ciągłym wytrząsaniem przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
- Umyć szkiełka wodąddH 2O (o ile nie określono inaczej, mycie odbywa się przy użyciu ddH2O).
- Powtórz krok mycia ~10x, aby całkowicie usunąć roztwór blokujący z powierzchni szkiełka. Jest to ważne, aby uzyskać jednolite i niskie tło.
- Usuń nadmiar wody z powierzchni zjeżdżalni i przejdź do następnego kroku, nie dopuszczając do wyschnięcia szkiełek.
- Przygotować roztwór sprzęgający, rozpuszczając 3% mleka w proszku w odczynniku sprzęgającym.
- Dodać 6 ml roztworu sprzęgającego i do pełnej ilości wcześniej przygotowanej próbki białka biotynylowanego z kroku 12.
- Umieść jedno szkiełko w jednym dołku komory sprzęgającej dostarczonej przez dostawcę i dodaj do niego ~6 ml mieszanki sprzęgającej białka.
nuta: Upewnij się, że szkiełko jest całkowicie zanurzone w roztworze mieszanki sprzęgającej białka.
- Przykryć komorę sprzęgającą i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z ciągłym mieszaniem w wytrząsarce orbitalnej.
- Przenieś szkiełka na szalkę Petriego i dodaj 30 ml 1x buforu do mycia. Umieść szalkę Petriego w wytrząsarce orbitalnej, potrząsaj przez 10 minut i wyrzuć roztwór.
- Powtórz krok 24 2x.
- Dokładnie spłucz szkiełka wodą ddH2O, jak opisano w krokach 17 i 18, a następnie natychmiast przejdź do następnego kroku, aby uniknąć wysuszenia.
- Dodać 30 μl Cy3-streptawidyny (0,5 mg/ml) do 30 ml buforu detekcyjnego.
- Umieścić szkiełko na szalce Petriego i dodać 30 ml buforu detekcyjnego zawierającego Cy3-streptawidynę.
- Inkubować w wytrząsarce orbitalnej przez 20 minut z ciągłym wytrząsaniem chronionym przed światłem.
nuta: Cy-3 jest barwnikiem fluorescencyjnym. Przykryj folią aluminiową lub pracuj w ciemnych warunkach, aby utrzymać intensywność fluorescencji.
- Wykonaj kroki 24-26 i pozostaw szkiełko do wyschnięcia, używając delikatnego strumienia powietrza lub umieszczając szkiełko w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i wiruj przy 1300 x g przez 5-10 minut.
- Umieść szkiełko w uchwycie na suwak i przykryj folią aluminiową.
- Zeskanuj szkiełko w skanerze mikromacierzowym o odpowiednich długościach fal wzbudzenia i emisji. W przypadku Cy3 szczyt długości fali wzbudzenia przypada na ~550 nm, a pik emisji na ~570 nm.
- Przeanalizuj dane (patrz tabela materiałów dla używanego oprogramowania).