Przygotowanie płuc myszy do cytometrii przepływowej: generowanie zawiesiny komórkowej z tkanki płucnej do analizy cytometrii przepływowej

Streszczenie

Źródło: Moll, H. P., et al. Ortotopowy przeszczep komórek gruczolakoraka płuc w celu zbadania ekspresji PD-L1. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film opisuje przygotowanie zawiesiny komórek płuc myszy do analizy metodą cytometrii przepływowej w celu zbadania ekspresji PD-L1 komórek gruczolakoraka płuc.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.

1. Przygotowanie płuc do cytometrii przepływowej

1. W pożądanym eksperymentalnym punkcie końcowym uspokoić mysz poprzez podskórne wstrzyknięcie mieszaniny ketaminy (100 mg/kg masy ciała) i ksylazyny (10 mg/kg masy ciała) i poddać ją eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.
2. Namocz tuszę w 70% etanolu i zabezpiecz mysz na desce sekcyjnej za pomocą taśmy.
3. Wykonaj brzuszne nacięcie linii środkowej i delikatnie odwróć skórę, aby odsłonić mięśnie ściany klatki piersiowej i narządy jamy brzusznej. Nakłuj przeponę i przetnij żebra nożyczkami, aby odsłonić klatkę piersiową.
4. Wykonaj 3-krotną perfuzję płuc za pomocą 6 - 8 ml lodowatego PBS przez prawą komorę za pomocą igły 27 G po wycięciu małego otworu w lewej komorze, aby umożliwić odpływ krwi. Płuca powinny zostać oczyszczone z krwi i całkowicie białe.
5. Wyjmij płuca i zmiel płaty na małe kawałki za pomocą nożyczek. Przenieś fragmenty płuc do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml i inkubuj ją w 1,5 ml buforu do wytrawiania płuc (RPMI, 5% FCS, 150 U/ml kolagenazy I i 50 U/ml DNazy I).
6. Inkubować fragmenty płuc przez 30-60 minut w temperaturze 37 °C i przy ciągłym wstrząsaniu.
7. Przenieść zawiesinę komórek płuc przez sitko o pojemności 70 μm do probówki o pojemności 50 ml. Wyczyść sitko grzbietem sterylnej strzykawki o pojemności 10 ml i przepłucz sitko 15 ml PBS z 2% FCS.
8. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odessać supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu lizującego chlorek amonu i potas (ACK) i inkubować je przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu lizy pozostałych erytrocytów.
9. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS z 2% FCS i postępować zgodnie z żądanym protokołem barwienia dla cytometrii przepływowej
   nuta: Alternatywnie, komórki można ponownie zawiesić w RPMI zawierającym 30% FCS i 10% DMSO i zamrozić przy użyciu pojemnika do zamrażania w celu późniejszej analizy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Linia komórkowa gruczolakoraka płuc myszy			Izolowane we własnym zakresie
Myszy C57Bl/6			Można użyć F1 krzyża dwóch teł (8-12 tygodni)
Myszy 129S
RPMI 1640 Średni	Technologie życiowe	11544446
Surowica cielęca płodu	Technologie życiowe	11573397
Roztwór penicyliny/streptomycyny	Technologie życiowe	11548876
L-glutamina	Technologie życiowe	11539876
Ketasol (100 mg/ml ketaminy)	Ogris Pharma	Numer katalogowy: 8-00173
Ksylasol (20 mg/ml ksylazyny)	Ogris Pharma	Numer katalogowy: 8-00178
kleszcze	Roboz powiedział:	Złącze RS8260
Nożyczki do tęczówki dla studentów	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 91460-11
DNaza I (bez RNaz)	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	Zobacz materiał M0303S
Kolagenaza typu I	Technologie życiowe	17100017
Bufor Lizy ACK	Lonza	10-548E