Test ksenoprzeszczepu danio pręgowanego: metoda oceny skuteczności przeciwnowotworowej leków na rakotwórczość u danio pręgowanego in vivo

Streszczenie

Źródło: Lee, J. Y et al.,Przedkliniczna ocena bioaktywności przeciwnowotworowej kumaryny OT48 za pomocą sferoidów, testów tworzenia kolonii i ksenoprzeszczepów danio pręgowanego.J. Vis. Exp. (2018)

Ten film opisuje test ksenoprzeszczepu danio pręgowanego w celu oceny powstawania nowotworów in vivo i zbadania efektu środków terapeutycznych.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Test ksenoprzeszczepu danio pręgowanego

UWAGA: To techniczne podejście jest przedstawione jako schemat (Rysunek 1).

1. Przygotowanie odczynników podstawowych
   1. Przygotuj 1 l 30x roztworu Danieau: 1740 mM NaCl, 21 mM KCl, 12 mM MgSO₄•7H2O, 18 mM Ca(NO₃)₂ i 150 mM HEPES. Dostosować pH buforu do 7,6 za pomocą pH-metru.
   2. Przygotować 1% (50x) roztwór trykainy: Rozpuść 20 mg metanosulfonianu etylu 3-aminobenzoesanu (trikainy) w 2 ml wody destylowanej.
   3. Przygotować 1% roztwór fenolu Red-PBS: Dodać 2 μl roztworu soli sodowej czerwieni fenolowej do 198 μl wysterylizowanego roztworu PBS w probówce o pojemności 1,5 μl.
   4. Przygotuj 3% metylocelulozy: Dodaj 3 g metylocelulozy do 100 ml 1x roztworu Danieau.
2. Produkcja i inkubacja ikry danio pręgowanego
   1. Oddziel jedną samicę i jednego samca danio pręgowanego w zbiorniku wypełnionym sterylizowaną promieniami UV i przefiltrowaną wodą z kranu o temperaturze 28,5 °C w ciemności. Po 24 godzinach separacji wymieszaj ryby obu płci, aby rozpocząć krycie. Przenieść zapłodnione jaja ze zbiornika krycia na szalkę Petriego zawierającą 5 ml świeżego roztworu Danieau.
   2. Umyj jajka trzy razy 5 ml roztworu Danieau. Do umycia ostrożnie odessać jaja pipetą i przenieść do 5 ml świeżego roztworu. Inkubować przez 8 godzin w temperaturze 28,5 °C.
      1. Po 8 godzinach inkubacji w roztworze Danieau zmienić roztwór na Danieau zawierający 0,03% 1-fenylo-2-tiomocznika (PTU) w celu zahamowania pigmentacji. Sortuj nieprzezroczyste jaja (niezapłodnione lub zawierające nierozwinięte zarodki), aby zapobiec zakażeniu.
3. Dechorionacja zarodka
   1. 24 godziny po zapłodnieniu (HPF) Dechorionate zarodki danio pręgowanego za pomocą ostrych kleszczy. Inkubować wylęgające się zarodki w roztworze Danieau z 0,03% PTU w temperaturze 28,5 °C do 48 hpf.
4. Przygotowanie komórek poddanych działaniu związków chemicznych
   1. Nasiona komórek A549 w ilości 20 000 komórek/cm,² w 25 cm, kolby hodowlane. Po 24 godzinach od wysiewu dodawać związki (tutaj OT48 w temperaturze 50 μM i/lub A1210477 w temperaturze 20 μM) przez 24 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   2. Ustal czas leczenia dla każdego związku, aby utrzymać żywotność komórek, ale zaangażować je w śmierć komórki. Ten punkt czasowy musi być indywidualnie ustalony na podstawie żywotności komórki, morfologii i markerów molekularnych.
   3. Na 2 godziny przed zakończeniem zabiegu wybarwić komórki 4 μM barwnika fluorescencyjnego CM-Dil w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Po 2 godzinach inkubacji trypsynizować komórki 0,05% trypsyną-EDTA, a przed wstrzyknięciem rozcieńczyć 106 komórek w 50 μl roztworu fenolu Red-PBS.
5. Mikroiniekcja komórek nowotworowych w celu wytworzenia ksenoprzeszczepu
   1. Znieczulenie danio pręgowanego w 0,02% roztworze tricainy przez 5 minut, aż osiądą na płytce agarowej.
   2. Pociągnij szklaną kapilarnę o średnicy zewnętrznej 1,0 mm (OD)) za pomocą ściągacza do mikropipet (Ustawienia programu: P: 300, Ciepło: 260, Ciągnięcie: 60, VEL: 50 i Czas: 200). Przeciąć mikrokapilę strzykawką, aby uzyskać ostrą krawędź. Załaduj mikrokapilary 20 μl roztworu komórki/fenolu Red-PBS. Ustawić ciśnienie i czas wtrysku, aby dozować 2 nL na wstrzyknięcie.
   3. Wstrzyknąć 100–200 komórek do woreczka żółtkowego, wstrzykując od 6 do 10 nL w 3 do 5 wstrzyknięciach. Po wstrzyknięciu należy pozostawić ryby do regeneracji przez 10 do 30 minut w 5 ml świeżego roztworu Danieau zawierającego roztwór PTU. Ryby należy wysłać na 24-dołkowe płytki z 1 ml roztworu Danieau zawierającego roztwór PTU i inkubować przez 72 godziny w temperaturze 28,5 °C.
   4. Po 72 godzinach inkubacji znieczulić ryby w 0,02% roztworze tricainy i unieruchomić na szkiełku z kroplą 3% metylocelulozy. Wykonaj 5-krotne zdjęcia za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o długości fali od 620 do 750 nm.
   5. Określ ilościowo rozmiar guzów fluorescencyjnych za pomocą oprogramowania ImageJ. Wybierz menu "Analizuj | Środek". Zapisz wartości odpowiadające sygnałowi fluorescencyjnemu i analizuj je za pomocą oprogramowania statystycznego do graficznej reprezentacji.

Wyniki

Rysunek 1: Schemat ideowy całego procesu testu ksenoprzeszczepu danio pręgowanego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ciągnik siodłowy A549	Kontroler ATCC (Kontroler T	Zobacz materiał CCL-185	37 stopni Celsjusza
Silnik RPMI 1640	Lonza	Numer katalogowy: 30096	4 ° C
FBS (Sieć Usługowa	Biowest (Zachód Biologi	S1520-500	-20 stopni Celsjusza
Penicylina-streptomycyna	Lonza	17-602E	-20 stopni Celsjusza
Kolba do hodowli komórkowych T25	Spl	Numer katalogowy: 70025	Rt
Kolba do hodowli komórkowych T75	Spl	Numer katalogowy 70075	Rt
Kolba do hodowli komórkowych T175	Spl	Numer katalogowy: 71175	Rt
Tubka 1,5 ml	Ekstragen	Rurka-170-C	Rt
Płytka 24-dołkowa	Spl	Numer katalogowy 30024	Rt
Petrydyjczyk	Spl	Numer katalogowy 10100	Rt
Rozwiązanie PBS	Klon	SH30256.02	Rt
Trypsyna-EDTA	Gibco (firma Gibco)	25-300-054	4 ° C
chlorek sodu	Sigma-Aldrich	Numer telefonu 71382	Rt
Chlorek potasu (KCL)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P9541	Rt
Siarczan magnezu siedmiowodny (MgSO4,7H2O)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M2773	Rt
Azotan wapnia czterowodny (Ca(NO3)2)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C1396	Rt
Rozwiązanie HEPES	Sigma-Aldrich	H0887	Rt
3-aminobenzoesan etylu metanosulfonian (trikaina)	Sigma-Aldrich	E10521	Rt
Roztwór czerwieni fenolowej	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P0290	Rt
Metyloceluloza	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M0512	Rt
1-fenylo-2-tiomocznik (PTU)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P7629	Rt
Barwnik CM-Dil	Invitrogen	Zobacz materiał C7001	-20 stopni Celsjusza
Kapilara szklana	Światowe instrumenty precyzyjne	TW 100F-4	Rt
Ściągacz do mikropipet	Przyrząd migawkowy, USA	Zobacz materiał P-97	Rt
Mikro wtryskiwacz	Światowe instrumenty precyzyjne	Zobacz materiał PV820	Rt
strzykawka	KOVAX	1ml	Rt
Mikro ładowarka	Eppendorf	5242956003	Rt
Zjeżdżalnia szklana	Lotnisko Marienfeld	HSU-1000612 (Moduł HSU-1000612	Rt
Mikroskopia fluorescencyjna	Księga Leica	DE/DM 5000B	Rt

TGL TGL powiedział: powiedział: powiedział: TGL powiedział: powiedział: )