Test immunofluorescencyjny: metoda identyfikacji komórek nowotworowych wychwyconych na przewodzie medycznym

Streszczenie

Źródło: Gallerani, G. et.al., Charakterystyka komórek nowotworowych za pomocą przewodu medycznego do wychwytywania krążących komórek nowotworowych: podejście 3D oparte na immunofluorescencji i DNA FISH. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film opisuje technikę barwienia immunofluorescencyjnego krążących komórek nowotworowych uchwyconych na funkcjonalizowanym przewodzie medycznym. Funkcjonalizowany przewód umożliwia izolację CTC in vivo, bezpośrednio z krwiobiegu pacjenta.

Protokół

1. Ryba immuno-DNA na drutach

1. Impuls linii komórkowej na przewodzie (obsługa 3D)
   nuta: Wstępna konfiguracja obejmuje dokładny wybór przylegających linii komórek w oparciu o dodatni wynik EpCAM. Drut jest funkcjonalizowany przeciwciałami anty-EpCAM, dzięki czemu barwione są tylko komórki EpCAM-dodatnie.
   nuta: Nie dotykaj funkcjonalnej części przewodu, aby uniknąć uszkodzeń.
   nuta: Wszystkie czynności należy wykonywać pod okapem z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach.
   1. Ponownie zawiesić całą zawartość kolby T75 (80% konfluencji) w fiolce o pojemności 5 ml, używając 4 ml kompletnego podłoża; dla pojedynczego impulsu zaleca się około 2 000 000 komórek, aby zmaksymalizować przyczepność komórek do drutu.
   2. Wyjmij drut ze szklanego opakowania.
   3. Zanurzyć funkcjonalizowaną złotą część drutu w fiolce, upewniając się, że korek druciany jest wodoszczelnie dopasowany do fiolki. Uszczelnić folią laboratoryjną.
      nuta: Zaleca się użycie probówki o pojemności 5 ml, aby umożliwić prawidłowe dopasowanie korka drucianego do fiolki.
   4. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w rotatorze probówki (kąt 0-120).
   5. Przepłukać drut trzy razy w roztworze 1× PBS, używając 3 różnych czystych fiolek.
2. Utrwalanie i przepuszczalność
   ostrożność: Aceton jest substancją łatwopalną, która może podrażniać drogi oddechowe. Używaj wyłącznie tworzyw sztucznych lub szklanych pojemników odpornych na aceton (bez PVC lub PVDF).
   nuta: Wykonaj te czynności pod wyciągiem chemicznym.
   1. Wysuszyć drut na powietrzu.
   2. Napraw ogniwa, zanurzając drut w 100% roztworze acetonu na 10 minut w temperaturze pokojowej. Użyj probówki o pojemności 5 ml.
      nuta: Ogranicznik drutu nie może stykać się z utrwalaczem.
   3. Suszyć drut na powietrzu przez 5 minut w temperaturze RT.
      nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Drut należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Podczas pakowania drutu do długotrwałego przechowywania, umieść korek drutu obok funkcjonalnej końcówki i ostrożnie włóż drut do szklanej rurki do przechowywania, uważając, aby nie uszkodzić funkcjonalnej końcówki. Zamknąć szklankę do przechowywania i przechowywać (pionowo lub poziomo) w temperaturze -20 °C.
3. Immunofluorescencja Dzień 1
   nuta: Ten etap obejmuje całonocną inkubację (~ 16 h).
   1. Umyć dwukrotnie w roztworze 1× PBS za pomocą probówki o pojemności 5 ml.
   2. Inkubować drut w buforze do rozcieńczania przeciwciał przez 30 minut w temperaturze pokojowej przy użyciu probówki o pojemności 5 ml.
   3. Przygotować 150 μl mieszaniny przeciwciał z rozcieńczeniem pierwszorzędowego przeciwciała monoklonalnego sprzężonego z fluorochromem w buforze do rozcieńczania przeciwciał, jak określono w karcie katalogowej. Na przykład przeciwciało EpCAM-FITC zastosowano w rozcieńczeniu 1:20.
   4. Użyj końcówki p200 do przeprowadzenia inkubacji w następujący sposób: Wyjmij drut z korka drutu i delikatnie włóż drut przez większy otwór końcówki. Najpierw włóż niefunkcjonalny koniec i powoli przeciągnij drut przez mniejszy otwór, aż złota część znajdzie się tuż za większym otworem.
   5. Delikatnie wrzuć 150 μl mieszanki przeciwciał (na przykład przeciwciała anty EpCAM_FITC rozcieńczone w stosunku 1:20) do końcówki. Aby uniknąć ryzyka tworzenia się pęcherzyków, delikatnie obracaj drut, aż funkcjonalizowana część zostanie całkowicie zanurzona.
   6. Uszczelnij otwór końcówki. Pomocne może być owinięcie folii laboratoryjnej wokół otworu.
   7. Inkubować pionowo przez noc (~ 16 h) w ciemności w temperaturze 4 °C.
4. Immunofluorescencja dzień 2
   1. Zablokuj inkubację przeciwciał, przemywając drut dwukrotnie w 1× PBS.
   2. Włóż drut ponownie do korka drutu.
      nuta: Przechowywać w 1X PBS w temperaturze 4 °C w fiolce o pojemności 5 ml do czasu przeprowadzenia testu FISH.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
etanol	Carlo Erba	# 414605
Animacja 20	BIO RAD	# 1706531
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)	Medicago	# 09-9400-100
aceton	Sigma Aldrich	# 534064-500ML
CEMENT KAUCZUKOWY	Królewskie Talens	# 95306500
EpCAM-FITC (klon: HEA-125)	Mitenyi	#130-080-301
Silnik RPMI 1640	Gibco (firma Gibco)	# 31870-025
XT ALK BA	Sondy MetaSystems	# D-6001-100-OG
Detektor CANCER01 EpCAM	Gilupi Nanomedizin		Drut funkcjonalizowany
Mikroskop fluorescencyjny ZEISS Axioskop	Zeiss
Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 64-bitowe oprogramowanie	Nikon
12-bitowy aparat cyfrowy Nikon DS-QiMc	Nikon	DS-QiMc