$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Pobieranie próbek osocza
- Zebrać 10 ml próbki krwi pełnej w probówkach Vacutainer z pokrytym sprayem K2EDTA i przechowywać w temperaturze pokojowej.
nuta: Aby zminimalizować hemolizę, oddziel osocze w ciągu 2 godzin. Nie przechowuj pełnej krwi w niskiej temperaturze (tj. 4 °C), aby uniknąć szoku termicznego i lizy komórek, które prowadzą do niespecyficznego uwalniania miRNA.
- W ciągu 1 godziny oddzielić osocze przez pierwszy etap wirowania w temperaturze 1,258 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut.
- Przenieść supernatant osocza do probówki o pojemności 15 ml, ostrożnie unikając kontaktu z pierścieniem limfocytarnym.
- Odwirować osocze po raz drugi w temperaturze 1,258 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut.
- Podzielić 1 ml osocza na 1,5 ml kriowialiów, unikając zbierania frakcji osocza u podstawy probówki.
- Przechowywać wszystkie podwielokrotności w temperaturze -80 °C, z wyjątkiem jednej przeznaczonej do oceny hemolizy. Analizę molekularną należy przeprowadzić w ciągu 5 tygodni.
2. Ekstrakcja całkowitego RNA z osocza
- Przygotować roztwór 1-tioglicerolu/homogenizacji (OMG) z 20 μl 1-tioglicerolu na ml roztworu homogenizacyjnego. Ponieważ 1-tioglicerol jest lepki, należy ostrożnie odpipetować pipetę, aby uzyskać dokładny pomiar. Przed użyciem schłodzić roztwór OMG na lodzie lub w temperaturze 2-10 °C.
nuta: Roztwór roboczy jest stabilny w temperaturze 2-10 °C przez 1 miesiąc.
- Zawiesić liofilizowaną DNazę I, dodając do fiolki 275 μl wody wolnej od nukleaz i delikatnie wymieszać (nie wirować). Jako pomoc wizualną dodać 5 μl niebieskiego barwnika do odtworzonej DNazy I i dozować roztwór do jednorazowych podwielokrotności w probówkach bez nukleaz. Rozpuszczoną DNazę I przechowywać w temperaturze od -30 °C do -10 °C.
- Zaczynając od 200 μl osocza, dodaj 200 μl schłodzonego roztworu OMG.
- Vortex 15-30 s, aby zapewnić pełną homogenizację. Jeśli dojdzie do pienienia, pozwól próbce osiąść na lodzie.
- Dodać 200 μl buforu do lizy i 25 μl proteinazy K do homogenizowanej próbki i wirować przez 20 s.
- Inkubować próbki przez 15 minut w termomikserze podgrzanym do temperatury 37 °C.
- Załaduj wkład dla każdej próbki na tacę pokładową instrumentu i umieść zatyczkę we właściwej pozycji.
- Przenieś lizat do odpowiedniej pozycji we wkładzie instrumentu.
- Dodać 5 μl roztworu DNazy I do odpowiedniego miejsca we wkładzie
.
- Dodać 60 μl wody wolnej od nukleaz do podstawy każdej probówki elucyjnej.
- Wybierz metodę "RSC miRNA Tissue" i rozpocznij automatyczny przebieg oczyszczania. Całkowite próbki RNA mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C.