Barwienie immunohistochemiczne: metoda uzyskiwania informacji przestrzennych z cienkich skrawków tkanek

Abstract

Źródło: Baharom F. et al., Ludzkie komórki dendrytyczne płuc: Rozkład przestrzenny i identyfikacja fenotypowa w biopsjach wewnątrzoskrzelowych przy użyciu immunohistochemii i cytometrii przepływowej. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film opisuje technikę barwienia immunohistochemicznego w celu identyfikacji komórek dendrytycznych z biopsji wewnątrzoskrzelowych.

Protocol

1. Podział na sekcje GMA.

1. Przygotuj 0,05% roztwór amoniaku z wodą destylowaną. Umieść szklany nóż i biopsję w mikrotomie. Ostrożnie wyrównaj blok biopsyjny z ostrzem, regulując uchwyt noża i kąt bloku biopsyjnego tak, aby ostrze spoczywało płasko na powierzchni bloku.
2. Wytnij odcinki o grubości 2 μm za pomocą mikrotomu z małą prędkością cięcia i użyj kleszczy do przenoszenia i wypływu sekcji na wodzie amoniakalnej. Unosić sekcje przez 45-90 sekund, umożliwiając delikatne pobranie antygenu i rozwinięcie sekcji.
3. Podnieś sekcje za pomocą szkiełka mikroskopowego. Sprawdź histologię biopsji, szybko barwiąc błękitem toluidyny.
4. Wysuszyć szkiełka na płycie grzejnej ustawionej na 50 °C i nanieść 500 μl przefiltrowanego barwnika toluidynowego na wycinek za pomocą plastikowej pipety Pasteura. Ogrzej część na płycie grzejnej, aż na krawędzi plamy zacznie pojawiać się zielony pierścień, a następnie zmyj go wodą.
5. Za pomocą mikroskopu świetlnego sprawdź histologię biopsji. Skrawki stosowane do immunohistochemii powinny zawierać dobre obszary nieuszkodzonej blaszki właściwej i nabłonka, z jak najmniejszą liczbą gruczołów i jak najmniejszą ilością mięśni gładkich.
6. Wytnij odcinki, które mają dobrą histologię i podnieś je za pomocą szkiełek mikroskopowych pokrytych poli L-lizyną (pokrytych PLL) do barwienia immunohistochemicznego. Wytnij co najmniej dwa skrawki z każdej biopsji do analizy. Suszyć szkiełka przez co najmniej 1 godzinę. Po wyschnięciu skrawki można zawinąć w folię aluminiową i przechowywać w temperaturze -20 °C do 2 tygodni lub można je natychmiast wybarwić immunologicznie.

2. Barwienie immunohistochemiczne biopsji wewnątrzoskrzelowych wbudowanych w GMA

UWAGA: Azydek sodu jest toksyczny. Przygotować 0,1% roztwór azydku sodu w dygestoriach, z dala od kwasów. Kontakt z kwasami uwalnia toksyczne gazy.

1. Narysuj sekcje za pomocą pisaka z diamentową końcówką i ułóż slajdy na stojaku do barwienia.
2. Wykonaj blok peroksydazy. Przygotować roztwór blokowy peroksydazy składający się z 0,3% nadtlenku wodoru w 0,1% roztworze azydku sodu. Nanieść 1 ml bloku peroksydazy na skrawki i inkubować przez 30 minut.
3. Przygotować roztwór płuczący z 0,05 M soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS), pH 7,6. Umyj szkiełka w TBS, 3x 5 min.
4. Przygotować 1% roztwór blokowy BSA w DMEM. Zrób to z wyprzedzeniem i w dużych ilościach, podwielokrotn i zamroź do czasu, aż będzie potrzebny. Opróżnić szkiełka i inkubować skrawki w roztworze blokowym przez 30 minut, aby zablokować niespecyficzne wiązanie przeciwciał. Jeśli nadal występuje niespecyficzne wiązanie, należy przeprowadzić 30-minutowy etap inkubacji z 5% blokiem surowicy tego samego gatunku co przeciwciało drugorzędowe.
5. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe (CD45 lub CD1a) w TBS do pożądanego stężenia (CD45 rozcieńczone w stosunku 1:1,000; CD1a rozcieńczony w stosunku 1:1,00) i nakładać na szkiełka podstawowe. Szkiełko nakrywkowe należy nakryć skrawki i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.
6. Umyj slajdy w TBS trzy razy. Rozcieńczyć biotynylowane przeciwciało drugorzędowe (skierowane przeciwko pierwszorzędowemu gatunkowi przeciwciała gospodarza, w tym przypadku króliczemu przeciwciału anty-myszemu F(ab'₂)) w TBS do pożądanego stężenia (rozcieńczenie 1:300) i nałożyć na szkiełka. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
7. Przygotować kompleks biotyny i peroksydazy streptawidyny co najmniej 30 minut przed użyciem. Upewnij się, że jest wystarczająco dużo, aby zakryć wszystkie slajdy. Umyj szkiełka w TBS trzy razy. Nanieść roztwór na szkiełka i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
8. Umyj szkiełka w TBS trzy razy. Przygotować roztwór substratu peroksydazy 3-amino-9-etylokarbazolu (AEC) (wykonany zgodnie z instrukcjami producenta). Nałóż go na szkiełka i inkubuj przez 20-30 minut lub do momentu uzyskania pożądanej intensywności plamy.
9. Opłucz szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut. Przeciwbarwić skrawki przefiltrowanym roztworem hematoksyliny Mayera przez 2 minuty. Myj szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut.
10. Opróżnij szkiełka i przykryj sekcje trwałym wodnym medium montażowym. Wysuszyć szkiełka w temperaturze 80 °C w suszarce. Poczekaj, aż szkiełka ostygną, a następnie zamontuj je za pomocą DPX i umieść szkiełko nakrywkowe.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Podział na sekcje GMA
Szkiełka mikroskopowe szklane	ThermoFisher Naukowy	10143562CEF (płyta CEF)	Krawędzie cięte, koniec matowy
Roztwór poli-L-lizyny	Sigma-Aldrich	P8920-500 ml	1:10 dla roztworu roboczego
Paski szklane do ultramikrotomii	Alkar
Animacja 20	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P2287	Roztwór do płukania (0,1% Tween20)
LKB 7800B Knifemaker	LKB
Rozdzielacz kapsułek	Laboratoria TAAB	Zobacz materiał C065
Ostrza jednoostrzowe ze stali węglowej	Laboratoria TAAB	Zobacz materiał B054
imadło
Amoniak, 25%	Firma VWR	1133.1	2 ml w 1 l, 1:500 (0,05%)
Mikrotom	Księga Leica		Leica RM 2165
Źródło światła	Księga Leica		Leica CLS 150 XE
Mikroskop ze statywem na ramię wahadłowe	Księga Leica		Leica MZ6
Immunohistochemia GMA
Pióro z diamentową końcówką	Histolab	Numer katalogowy: 5218
Nadtlenek wodoru 30% roztwór	AnalaR Normapur	Numer katalogowy 23619.264
Azydek sodu	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S8032
Tris	Roche	10708976001
chlorek sodu	Chemikalia VWR	Numer katalogowy 27810.295
Albumina surowicy bydlęcej	Milipory	82-045-2	Stopień diagnostyczny Probumin BSA
Zmodyfikowany orzeł Dulbecco średni (DMEM)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D5546
Przeciwciało anty-ludzkie CD45	Legenda biologiczna	304002	Mysz monoklonalna, klon HI30, izotyp IgG1k. Stężenie robocze 500 ng/ml
Przeciwciało anty-ludzkie CD1a AbD	Serotech (Technologia Serotech)	MCA80GA	Mysz monoklonalna, klon NA1/34-HLK, izotyp IgG2a. Stężenie robocze 10 μg/ml
Mysz monoklonalny izotyp IgG1 kontrola	Księga Abcam	ab27479
Mysi monoklonalny izotyp IgG2a kontrola	Dako Dako	X094301-2
Standardowy zestaw Vectastain ABC Elite	Laboratoria wektorowe	PK-6100
AEC (3-amino-9-etylokarbazol) Latawiec z substratem peroksydazy	Laboratoria wektorowe	Zobacz materiał SK-4200
Hematoksylina Mayersa	Laboratorium HistoLab	Rok 1820
Stały montaż wodny Średni	AbD Serotech	BUF058C
Piec do suszenia
Rozwiązanie do montażu stałego DPX	Firma VWR	360292F
Mikroskop świetlny	Księga Leica		Leica DMLB
Kamera mikroskopowa	Księga Leica		Leica DFC 320
Oprogramowanie analityczne	Księga Leica		Leica Qwin V3