Izolacja egzosomów: technika oddzielania egzosomów od osocza pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc

Streszczenie

Źródło: Giallombardo, M., et al. Egzosomalna analiza miRNA w osoczu pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC) za pomocą qPCR: wykonalne narzędzie do płynnej biopsji. J. Vis. Exp.(2016).

Egzosomy izolowane z plazmy mogą być używane jako nieinwazyjny i powtarzalny sposób wykrywania i śledzenia biomarkerów do wczesnego wykrywania i postępu choroby. Ten film opisuje protokół oddzielania egzosomów od próbek osocza pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc, które można wykorzystać do ekstrakcji DNA i białek.

Protokół

1. Izolacja egzosomów

Uwaga: Izolacja egzosomów z próbek plazmy została przeprowadzona za pomocą komercyjnego zestawu, zgodnie z protokołem producenta i poprzez dodanie leczenia RNAza: (wszystkie te kroki muszą być wykonane przy użyciu środków ochrony osobistej i środowiskowej oraz zgodnie z określoną procedurą prawną dotyczącą manipulacji próbkami biologicznymi).

1. Pobrać 1 ml osocza z każdej próbki, przechowywanej w temperaturze -80 °C, i umieścić ją na lodzie.
2. Odwirować próbkę o masie 2 000 × g przez 20 minut w temperaturze pokojowej; przejście to jest obowiązkowe w celu usunięcia komórek i zanieczyszczeń.
3. Przenieść supernatant zawierający czyste osocze do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
4. Odwirować nową probówkę o masie 10 000 × g przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
5. Przenieść supernatant zawierający czyste osocze do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
6. Dodać 100 ng/ml RNAzy do supernatantu i inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 10 minut w celu degradacji krążących RNA.
7. Przenieść całe leczone osocze do nowej probówki o pojemności 2 ml i dodać 0,5 objętości 1x PBS.
8. Odwirować próbkę w celu wymieszania roztworów.
9. Dodać 0,05 objętości roztworu proteinazy K (dołączonego do zestawu) do próbki.
10. Wzniecić próbkę, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
11. Dodać 0,2 objętości buforu wytrącającego egzosomy do próbki i wymieszać roztwory przez inwersję.
12. Inkubować próbkę w temperaturze od 2 °C do 8 °C przez 30 minut, a następnie odwirować próbkę w temperaturze 10 000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
13. Odessać i wyrzucić supernatant. Osad zawiera izolowane egzosomy.
14. Dodaj wybrany bufor do osadu egzosomu w celu ponownego zawieszenia egzosomów. Dobór bufora zależy od planowanej dalszej analizy, w tym przypadku:
    1. Dodać 100 μl 1x PBS w celu przeprowadzenia analizy TEM.
    2. Dodać 346,5 μl specyficznego buforu do lizy do ekstrakcji RNA (z zestawu komercyjnego) (UWAGA: zagrożenie chemiczne).
    3. Dodać 100 μl buforu do lizy do ekstrakcji białek (Tris-HCl 50 mM pH 7,6 - NaCl 300 mM - Triton X-100 0,5% - PMSF 1 mM - Leupeptin/Aprotinin 10 μg/ml) w celu przeprowadzenia analizy Western Bloting. (UWAGA: zagrożenia chemiczne).
15. Zawieszone egzosomy należy przechowywać w temperaturze -20 °C.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do całkowitej izolacji egzosomów (z osocza)	Invitrogen	4484450	Stosuj leczenie proteinazą K
Rybonukleaza A	Sigma-Aldrich	Czynnik chłodniczy R4875-100MG
RNAspin Illustra mini zestaw 50	GE Opieka zdrowotna	25-0500-71