Wkraplanie i utrwalanie płuc: wprowadzanie płynu do tchawicy i mocowanie płuc w celu zmierzenia ustalonej objętości płuc

Streszczenie

Źródło: Limjunyawong, N. et al, Metody wkraplania i utrwalania przydatne w badaniach nad rakiem płuc u myszy. J. Vis. Exp. (2015).

Ten film opisuje prostą i niezawodną metodę wprowadzania płynu do tchawicy w celu wkroplenia płuc, utrwalenia i pomiaru objętości płuc.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.

1. Wkraplanie do płuc

1. Wybierz komercyjną kaniulę dożylną o długości jednego cala i długości 20 g, która zostanie użyta do intubacji.
2. Zmodyfikuj końcówkę cewnika, zginając ją ręcznie, aby uzyskać lekką krzywiznę na końcówce, jak pokazano na rysunku 1.
3. Znieczulić mysz mieszaniną ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (15 mg/kg) wstrzykniętym IP i potwierdzić znieczulenie przez brak ruchu odruchowego. Nałóż maść weterynaryjną na oczy natychmiast po znieczuleniu. Bezpośrednio po znieczuleniu nałóż maść weterynaryjną na oczy i podaj karprofen (5-10 mg/kg SQ) w celu znieczulenia pooperacyjnego i wkraplanego.
4. Umieść mysz na wznak na pochyłej platformie. Jak pokazano na rysunku 2, duży segregator biurowy z przyklejonymi pętlami do szwów działa doskonale.
5. Ogol brzuszną część szyi oraz oczyść i zdezynfekuj okolice szyi 70% alkoholem. W nowych rękawiczkach lateksowych i bezpudrowych używaj narzędzi chirurgicznych zdezynfekowanych 70% alkoholem.
6. Za pomocą ostrych nożyczek wykonaj małe nacięcie chirurgiczne na szyi około 12 mm poniżej dolnego siekacza.
7. Za pomocą kleszczy delikatnie pociągnij skórę na szyi doogonowo, aż będzie widać brzuszną ścianę tchawicy.
8. Delikatnie cofnij język i włóż kaniulę z wygiętą końcówką pochyloną w kierunku brzusznej powierzchni myszy. Podobnie jak w ppkt 1.4, delikatnie pociągnąć za skórę na szyi i wprowadzić kaniulę do tchawicy.
   nuta: Przy odrobinie wprawy cewnik będzie widoczny przesuwający się w dół tchawicy. Jeśli trafi do przełyku, nie będzie wizualnej obserwacji ruchu cewnika. W tchawicy nie wykonuje się żadnych nacięć.
9. Gdy cewnik jest widoczny w tchawicy na szyi, przesuń go o około 5 mm, aby niezawodnie przeszedł przez struny głosowe, ale nadal znacznie powyżej carina.
10. Przygotować się do wkroplenia do 50 μl płynu, wstrzykując go przez cewnik za pomocą końcówki pipety z żelem. Umieść końcówkę w piaście typu luer, ale przed wstrzyknięciem uważnie obserwuj ruch płynu w końcówce synchronicznie z oddechem myszy. Następnie wstrzyknąć zakroplony płyn.
11. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml natychmiast wykonaj stosunkowo szybkie napompowanie 0,6 ml powietrza do płuc przez cewnik, aby pomóc rozprowadzić płyn głęboko w płucach. Wyjmij kaniulę.
12. Wyjmij kaniulę.
13. Użyj niewielkiej ilości kleju cyjanoakrylowego, aby zamknąć małą ranę pooperacyjną zgodnie z instrukcją dołączoną do opakowania VetBond. Umieść myszy w indywidualnych klatkach i monitoruj je wizualnie, dopóki się nie obudzą i nie będą zachowywać się normalnie bez żadnych oznak dyskomfortu.

2. Pomiar stałej objętości płuc

1. Zmierz objętość płuc za pomocą zasady Archimedesa, jak pokazano na rysunku 3. Usunąć nieruchome płuco z formaldehydu i wyciąć serce oraz wszelką inną tkankę niepłucną.
2. Użyj wcześniej skonstruowanego, prostego, domowego urządzenia podtrzymującego drut, które służy do utrzymywania płuc całkowicie pod wodą.
   nuta: To urządzenie musi być kompatybilne z dowolną używaną wagą. Typowe urządzenie pokazane na rysunku 4 składa się z plastikowych pipet i cienkiego (20 G) drutu. System ten dobrze współpracuje z wagą używaną na filmie, ale można go łatwo dostosować do większości wag laboratoryjnych.
3. Umieścić zlewkę z ≈200 ml wody na wadze i wytarować z klatką podtrzymującą w wodzie. Zobacz rysunek 5. Wyjmij metalową klatkę; Umieść płuco na powierzchni wody i wciśnij klatkę pod wodę.
4. Zapisz masę na wadze. Liczba ta odzwierciedla objętość wypartej wody, a zatem jest bezpośrednią miarą objętości płuc. Należy uważać, aby płuco, szew lub jakakolwiek część drucianej klatki nie dotykała boków ani dna zlewki.
5. Aby uzyskać dokładność, powtórz ten pomiar. Wyjmij płuco z wody i osusz na chusteczce. Ponownie wytarować zlewkę z umieszczoną klatką i powtórzyć pomiar objętości płuc. Następnie należy uśrednić oba pomiary objętości.
   nuta: Jeśli płuca pozostaną w formalinie na dłużej niż około tygodnia, powietrze w płucach zostanie rozpuszczone w płynie. Kiedy tak się stanie, płuco zapadnie się, więc nie jest już konieczne używanie żadnego urządzenia, jak na rysunku 4, aby utrzymać płuco zanurzone. W takim przypadku objętość można zmierzyć, po prostu przytrzymując płuco za jeden ze sznurków szwowych, aż zostanie całkowicie zanurzone, jak pokazano na rysunku 3.

Wyniki

Rycina 1: Cewnik dożylny z lekko zakrzywioną końcówką używany do wkraplania.

Rycina 2: Nachylone 3-pierścieniowe spoiwo używane do podtrzymywania myszy podczas intubacji. Ten segregator może pomieścić 3 myszy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Waga laboratoryjna	Ohaus	Poszukiwacz przygód Pro Model AV 313	Można używać innych wag, jeśli mają zakres 1-300 g
20 g Cewnik dożylny Luer	Insylte		Kilku innych możliwych dostawców, np. Jelco Optiva
Butelka laboratoryjna 500 ml	rozmaity		Kilku innych możliwych dostawców