3D DNA RYBY: technika lokalizacji określonego genu na chromosomie

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Gallerani, G. et.al. Charakterystyka komórek nowotworowych za pomocą przewodu medycznego do wychwytywania krążących komórek nowotworowych: podejście 3D oparte na immunofluorescencji i DNA FISH. J. Vis. Exp. (2017).

Izolacja i charakterystyka krążących komórek nowotworowych (CTC) z krwi pacjentów z rakiem jest rodzajem nieinwazyjnej płynnej biopsji i wiąże się z nawrotem choroby i progresją choroby. Ten film opisuje technikę fluorescencji-hybrydyzacji DNA in situ (DNA FISH) na CTC uchwyconych na przewodzie medycznym w celu zbadania konkretnego genu będącego przedmiotem zainteresowania.

Protokół

1. 3D DNA-RYBA Dzień 2

UWAGA: Szczególną uwagę należy zwrócić na wysoką temperaturę instrumentów i wilgotną komorę.

Ustaw piec do hybrydyzacji i suchy piec grzewczy (~ 3 godziny przed uruchomieniem protokołu DNA-FISH). Ustawić piec do hybrydyzacji na 75 °C, ustawić suchy piec grzewczy na 37 °C i schłodzić roztwór 0,4× SSC (pH = 7,0 ± 0,1) do 4 °C.
nuta: Stan pH FISH jest krytyczny i musi wynosić 7,0 ± 0,1.
Umyj drut 3 razy w lodowatym roztworze 0,4× SSC.
nuta: Trzymaj drut w ciemności, aby uniknąć fotowybielania fluorochromu podczas poniższych procedur.
Suszyć przez 10 minut w ciemności pod dygestoriami.
Wiruj i obracaj sondę przez 5 s.
Wrzuć 10 μl sondy do szklanych mikroprobówek. Przykryj folią laboratoryjną.
Obracaj mikroprobówki w następujący sposób: zawiń mikroprobówkę w suchy absorbent, papier włóż do probówki o pojemności 50 ml i krótko wiruj.
Ostrożnie umieść wysuszony drut w mikroprobówce i włóż korek do drutu. Uszczelnić cementem gumowym.
ostrożność: Kolejne dwa kroki wiążą się z wysokimi temperaturami. Nosić rękawice ochronne.
Umieścić drut w ciemnej, wilgotnej komorze w piecu do hybrydyzacji na 8 minut w temperaturze 75 °C, aby uzyskać całkowitą denaturację DNA.
Przenieś wilgotną komorę do suchego piekarnika grzewczego w temperaturze 37 °C na noc.

2. 3D DNA-RYBA Dzień 3

Umieścić słoik do barwienia szkiełka z roztworem 0,4× SSC do łaźni wodnej i ustawić w temperaturze 72 °C.
Sprawdzić temperaturę roztworu 0,4× SSC, aż osiągnie 72 ± 1 °C.
Przygotować dwie szklane zlewki, jedną z roztworem 2× SSC + 0,05% Tween (pH = 7,0 ± 0,1), a drugą z wodą destylowaną.
Wyjmij wilgotną komorę z suchego piekarnika, ostrożnie usuń cement gumowy z korka drutu za pomocą pęsety i wyjmij drut.
nuta: Ostrożnie przeciągnij niepowlekany koniec drutu przez IN-Stopper, uważając, aby nie uszkodzić funkcjonalizowanej końcówki.
Zanurz drut w roztworze 0,4× SSC na 2 minuty w temperaturze 72 °C.
Umyj drut w roztworze 2× SSC + 0,05% Tween przez 30 s w temperaturze pokojowej.
Umyj drut w wodzie destylowanej o temperaturze pokojowej.
Suszyć drut pod wyciągiem przez 10 minut w ciemności.
Przygotować roztwór podstawowy DAPI o stężeniu 1,43 μM w 2 ml 1× PBS.
Inkubować funkcjonalizowaną końcówkę drutu z roztworem DAPI w fiolce o pojemności 2 ml przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze pokojowej.
Opłucz drut dwukrotnie w 1× PBS i wysusz na powietrzu.

3. 3D obserwacja i analiza mikroskopowa

Umieść przewód w uchwycie przewodu. Ostrożnie włóż funkcjonalną końcówkę przez punkt wejścia specjalnego uchwytu, aż końcówka dopasuje się do punktu złączenia. Uważaj, aby nie uszkodzić funkcjonalnej końcówki (Rysunek 1a).
Umieść specjalny uchwyt na stoliku mikroskopu. Wyreguluj ostrość mikroskopu za pomocą obiektywu 20×. Najpierw z grubsza skoncentruj się na specjalnym podparciu, a następnie dokładnie dostosuj komórki, które wydają się jasne w kanale DAPI.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

figure-results-1
Rysunek 1: Funkcjonalizowany przewód, schematyczne rozmieszczenie sond rozdzielających ALK, schemat oczekiwanych wzorców przegrupowania ALK i specjalny uchwyt.(a) Czerwone pola podkreślają trzy główne części drutu: funkcjonalną końcówkę, zatyczkę drutu i niefunkcjonalizowaną końcówkę. Funkcjonalna końcówka jest najdelikatniejszą częścią drutu i nie wolno jej dotykać...