Konserwacja tkanek zatopionych w parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE): metoda badania morfologii tkanek

Streszczenie

Źródło: Nagaraj A.S., et al., Ustalanie i analiza eksplantatów plastrów nowotworów jako warunek wstępny do testów diagnostycznych. J. Vis. Exp. (2018)

Poniższy film opisuje, jak zachować morfologię tkanki za pomocą utrwalania formaliny i zatapiania parafiny.

Protokół

1. Utrwalanie i przetwarzanie wycinków tkanek

1. Ostrożnie podnieść niehodowany 0 h referencyjna lub hodowany plasterek na bibułę filtracyjną nasączoną PBS.
   1. Aby to zrobić, dodaj 2-3 ml PBS na bibułę filtracyjną umieszczoną na 10-centymetrowej płytce. Umieść plasterek na bibule filtracyjnej i wyjmij bibułę filtracyjną za pomocą kleszczy.
   2. Przenieś bibułę filtracyjną do histokasesty i dodaj kroplę rozcieńczonej hematoksyliny (1:1 w wodzie dejonizowanej) na wierzch wycinka tkanki, aby widocznie zaznaczyć położenie wycinka podczas kolejnych etapów przetwarzania (ryc. 1D).
   3. Zamknij kasetę i przenieś ją do 4% neutralnego roztworu formaliny z buforem. Utrwalić tkanki przez noc w temperaturze 4 °C.
      nuta: Umieszczając plasterek na bibule filtracyjnej, upewnij się, że górna część plastra jest skierowana do góry; Jest to konieczne, aby podążać za górną, środkową i dolną sekcją wycinka podczas przekroju i analizy, jak opisano w kroku 2.3.
2. Następnego dnia przenieś kasety do 70% EtOH i natychmiast przystąp do etapu przetwarzania tkanek zatapiających parafinę.
3. Przed obróbką tkanek należy umyć histokasety w 100% EtOH 2x przez 10 minut każda. W takim przypadku użyj stacji mikrofalowej do przetwarzania tkanek. Wybierz program używany do grubości tkanki 1 mm i postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji (https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf).
   nuta: W przypadku korzystania z innych maszyn do przetwarzania tkanek należy używać programu odpowiedniego dla cienkich próbek tkanek.
4. W celu zatopienia w parafinie otwórz histokasę i za pomocą skalpela ostrożnie wyjmij plaster z bibuły filtracyjnej. Wyrzuć bibułę filtracyjną i przenieś plasterek do formy zawierającej ciekłą parafinę.
   1. Dociśnij chusteczkę do dna formy do zatapiania, na przykład płaskim ciężarkiem, aby zapewnić równomierne cięcie. Umieść dolną część histokasety na wierzchu formy, dodaj na nią płynną parafinę. Pozostaw formę do ostygnięcia na zimnym pasztecie przez 30 minut i oddziel formę od bloku parafinowego.
      nuta: Alternatywą dla osadzania poziomego jest osadzenie plastra guza w pionie, ustawiając plasterek w pozycji pionowej. Sekcje pionowe z łatwością pozwalają na analizę gradientów żywotności lub wyrażenia znacznika funkcjonalnego na pojedynczym odcinku. Analiza gradientu z poziomo osadzonymi warstwami wymaga przekroju parafiny, jak opisano w kroku 2.2.

2. Przetwarzanie i analiza tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE)

1. Przygotować cienkie skrawki tkanek FFPE o grubości 4 μm za pomocą mikrotomu. Podczas cięcia wyreguluj kąt bloku tak, aby powierzchnia bloku była zorientowana poziomo w stosunku do ostrza; Jest to konieczne, aby uzyskać równe odcinki w całej tkance.
2. Aby umożliwić uchwycenie potencjalnego gradientu żywotności wywołanego hodowlą, migracji komórek przez wycinki lub gradientów ekspresji biomarkerów w wycinkach hodowlanych, należy zebrać sekcje z górnej, środkowej i dolnej warstwy każdego z wycinków tkanki na szkiełkach obiektowych, jak wyjaśniono poniżej.
3. Najpierw zbierz sekwencyjne skrawki tkanki z wycinka tkanki zatopionej w parafinie w górnej części szkiełek podstawowych. Kontynuuj zbieranie odcinków głębszych warstw tkanek do środka, a następnie dolnej części szkiełek (ryc. 1E).
   nuta: Aby zmieścić trzy sekcje na szklanym szkiełku, odetnij nadmiar parafiny otaczającej osadzony plasterek tkanki.
4. Pozostawić skrawki do wyschnięcia na noc w temperaturze 37 °C i przystąpić do barwienia H&E lub immunohistochemii, jak opisano poniżej.
   nuta: Utrata antygenowości może wystąpić, gdy skrawki FFPE są przechowywane w wysokich temperaturach lub przez dłuższy czas. Zaleca się przechowywanie skrawków parafiny w temperaturze 4 °C, a analizy IHC należy przeprowadzić w ciągu 6 miesięcy po pocięciu.
   1. W przypadku barwienia H&E należy odparafinować i ponownie uwodnić skrawki parafiny w następujący sposób: ksylen 3x przez 5 min, 100% EtOH 3x przez 1 min, 96% EtOH 2x przez 1 min, 70% EtOH 1 x 1min i woda dejonizowana 2x przez 1 min.
   2. Inkubować skrawki w świeżo przefiltrowanym roztworze hematoksyliny przez 10 minut i myć pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut. Zanurzyć skrawki w kwaśnym alkoholu (1% HCl w 70% EtOH) przez 2 razy i myć pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut, a następnie inkubować z 0,5% eozyną przez 2 minuty.
   3. Po etapie eozyny należy odwodnić skrawki, zanurzając szkiełka w roztworach alkoholu i ksylenu w następujący sposób: 96% EtOH 2x przez 15 s, 100% EtOH 3x przez 30 s, ksylen 3x przez 1 min. Na koniec osadź sekcje w medium montażowym na bazie ksylenu.

Wyniki

Rycina 1: Schematyczne przedstawienie przepływu pracy w celu ustalenia i analizy eksplantatów plastrów pochodzących z mysiego NSCLC.(A) Schemat opisujący pobieranie i przygotowanie płuc zawierających guz do krojenia. Płaty płuc są pobierane od myszy, a tkanka nowotworowa jest wycinana z normalnej tkanki. grot strzałki i gwiazdka wskazują odpowiednio około 4 mm i 1 mm guzów. Biały gr...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płytka do hodowli tkankowej 10 cm	Sarstedt	83.1802 Rozdział 1802
Pbs	Lonza	BE17-517Q
Formaldehyd	rybak	F/1501/PB08
Potrójny papier kasetowy histo	Diagnostyka nowotworów	DX26280
Kasety histo	Firma VWR	Nr kat. 720-2199
Mikrotom	Thermo Fischer Naukowy	Zobacz materiał HM355S
Leica VT1200 S - mikrotom z wibrującymi ostrzami	Leica Biosystems	14048142066
Hematoksylina do barwienia H&E	Merck	Numer katalogowy: 1.09249.0500
Hematoksylina do barwienia przeciwdziałającego	Dako Dako	Zobacz materiał S3309
Eozyną	Sigma	E4382
Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS)	Sigma	Zobacz materiał H6648