$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie komórek i podłoża
- Przygotować pożywkę, używając 240 ml zmodyfikowanego podłoża Dubecco's Medium (IMDM) firmy Iscove i 50 ml płodowej surowicy bydlęcej. Nie należy rozmrażać płodowej surowicy bydlęcej w gorącej kąpieli wodnej, ponieważ gwałtowny wzrost temperatury może prowadzić do pogorszenia stabilności surowicy. Połączyć 240 μl gentamycyny 50 mg/ml i 5 ml penicyliny/streptomycyny 100x w standardowej kolbie hodowlanej i dodać do pożywki. Przechowywać pożywkę w temperaturze 4°C.
- Wysiewaj komórki U937 w ilości ~4 x 104 komórek/ml w kolbie o średnicy 25cm2 przy użyciu przygotowanej pożywki. Oceń komórki pod kątem koncentracji i żywotności za pomocą licznika komórek TC20 i wykluczenia błękitu trypanowego, umieszczając 15-20 μl komórek i 15-20 μl błękitu trypanowego w probówce mikrowirówki i mieszając zawartość. Odpipetować 15-20 μl tej mieszaniny do szkiełka do pobierania próbek TC20 i rozpocząć liczenie, umieszczając szkiełko w liczniku komórek TC20.
- Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i sprawdzić żywotność komórek za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego i licznika komórek TC20. Gdy komórki osiągną odpowiednie stężenie i/lub były poddawane działaniu środków sonosensybilizujących przez odpowiedni okres czasu, przenieść 3 ml komórek z kolby hodowlanej do szklanej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 20 ml. W tym protokole hoduj komórki U937 przez 48 godzin, a następnie traktuj 0,5, 1 lub 5 mM MeβCD przez 30 minut, aby wystarczająco zubożyć cholesterol w komórkach przed sonikacją.
2. Sonikacja komórek
- Odgazowuje dejonizowaną wodę destylowaną za pomocą próżni i kolby Buchnera. Przelej wodę do rogu kubka i napełnij do poziomu 15 mm powyżej górnej części klaksonu. Proces sonikacji powoduje dalsze odgazowanie wody przez okres kilku minut i może prowadzić do niespójności w trakcie eksperymentu, jeśli system nie zostanie uruchomiony przed sonikacją próbki. Dlatego należy uruchomić system na ~7 minut przed sonikacją próbki.
- Podłączyć fiolkę scyntylacyjną zawierającą komórki do urządzenia przytrzymującego. Następnie przymocuj urządzenie przytrzymujące do górnej części rogu kubka i ustaw na wysokości 15 mm od górnej części klaksonu (na powierzchni wody za pomocą mechanizmu przesuwnego).
- Komórki są zazwyczaj sonikowane za pomocą trzech 1-sekundowych impulsów ultradźwiękowych, z 1-sekundowym odstępem między każdym z tych impulsów. W przypadku tego protokołu należy sonikować komórki o amplitudzie 33% i 50% przy użyciu wyżej wymienionego dawkowania impulsowego.
3. Ocena komórek pod kątem uszkodzeń po sonikacji
- Oceń zawieszone ogniwa pod kątem uszkodzeń i żywotności za pomocą błękitu trypanowego i licznika komórek TC20. Ponadto należy przeanalizować próbkę za pomocą licznika Z2. W celu analizy licznika Z2 należy odpipetować zawiesinę komórek o objętości 100 μl do 20 ml izotonicznego roztworu soli fizjologicznej (w stosunku 200:1). Przed analizą należy przepłukać otwór analizatora cząstek Z2 co najmniej dwukrotnie roztworem soli fizjologicznej. Umieść próbkę Z2 w uchwycie licznika i podnieś platformę do otworu przed rozpoczęciem liczenia.
- Pozyskaj dane z liczników TC20 i Z2 za pomocą oprogramowania dostarczonego przez producenta. Przeanalizuj te dane pod kątem uszkodzenia komórek, żywotności i tworzenia się szczątków komórkowych w wyniku sonikacji.