Test XTT: test kolorymetryczny do oceny żywotności komórek i aktywności mitochondriów

Streszczenie

Trendowski, M., et al. Generacja i analiza ilościowa pulsacyjnego ultrasonografu o niskiej częstotliwości w celu określenia wrażliwości sonicznej nieleczonych i leczonych komórek nowotworowych. J. Vis. Exp. (2015)

Ten artykuł opisuje protokół testu XTT, który jest testem kolorymetrycznym do oceny żywotności komórek i aktywności mitochondriów.

Protokół

1. Test XTT do określenia żywotności komórek i aktywności mitochondrialnej leczonych komórek U937 i THP1

1. Przed testami XTT hoduj komórki U937 i THP1 w tych samych warunkach. Wstępnie potraktuj komórki tym samym zakresem stężeń MeβCD przez 30 minut przed sonikacją. Użyj tych samych parametrów ultradźwiękowych, co poprzednio, z wyjątkiem tego, że komórki są teraz sonikowane przy użyciu zakresu 1-3 impulsów jednosekundowych w odstępach jednej sekundy, aby rozwinąć zakres uszkodzeń, które zestaw XTT może ocenić.
   nuta: Wiele z tych kroków jest zaczerpniętych bezpośrednio z instrukcji zestawu XTT i są powtarzane tylko dla wygody zainteresowanych laboratoriów.
2. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 200 x g przez 10 minut. Ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce wzrostowej opisanej wcześniej. Ponownie zawiesić komórki przy ~ 1 x 10⁵ komórkach / ml. Komórki U937 należy zasiać w ilości 100 μl na studzienkę na płaskodenną 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania w trzech powtórzeniach, a następnie powtórzyć dla komórek THP1 przy użyciu oddzielnej płytki 96-dołkowej. Uwzględnij 3 studzienki kontrolne zawierające 100 μl samego kompletnego podłoża wzrostowego jako odczyty absorbancji ślepej próby. Następnie inkubować zaszczepione płytki przez 24 godziny.
3. Przed użyciem rozmrozić dwie porcje odczynnika XTT i odczynnika aktywacyjnego w temperaturze 37 °C. Delikatnie mieszać porcje, aż do uzyskania klarownych roztworów. Dodać 0,1 ml odczynnika aktywacyjnego do 5,0 ml odczynnika XTT, który tworzy wystarczającą ilość aktywowanego roztworu XTT do jednego 96-dołkowego testu na mikromiareczkowaniu. Powtórz ten proces dla drugiej płytki.
4. Dodać 50 μl aktywowanego roztworu XTT do każdej studzienki. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze CO₂ do hodowli komórkowych na 2 godziny. Po okresie inkubacji delikatnie wstrząsnąć płytką, aby równomiernie rozprowadzić pomarańczowy kolor w dołkach dodatnich. Zmierzyć absorbancję studzienek testowych zawierających komórki i studzienek kontrolnych ślepej próby tła przy długości fali od 450 do 500 nm za pomocą czytnika płytek do mikromiareczkowania.
5. Albo wyzerować czytnik płytek do mikromiareczkowania za pomocą ślepej próby kontrolnej, albo odjąć ich średnią wartość od konkretnych wyników. Ponownie zmierzyć absorbancję wszystkich studzienek testowych przy długości fali między 630-690 nm i odjąć wartości od uzyskanych wartości 450-500 nm. Uwaga: To drugie oznaczanie absorbancji pomaga wyeliminować niespecyficzne odczyty z wyników testu. Test XTT powtórzono czterokrotnie dla obu linii komórkowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zmodyfikowany Dulbecco's Medium z NaHCO3 i 25mM Hepes	Technologie życiowe	12440079
Zakłócacz ogniw Branson SLPe 40kHz z 3" (25mm) Cuphorn	Ultradźwięki Bransona	Numer katalogowy: 101-063-726	Sonikacja urządzenie
Końcówka pierwsza 100 μl i 1 000 μl	USA Naukowe	1120-1840, 1126-7810
Mikropipeta 100 μl	Wheaton	851164
Mikropipeta 1000 μl	Wheaton	851168
Forma Scientific Dwukomorowy zbiornik wodny Inkubator z płaszczem	Forma Scientific	3131
Zestaw do oznaczania proliferacji komórek XTT	Kontroler ATCC (Kontroler T	30-1011 tys.
96-dołkowy czytnik mikropłytek	Cole'a-Palmera	EW-13055-54
U937 Ludzkie komórki białaczki monocytowej	Kontroler ATCC (Kontroler T	CRL1593.2
Ludzkie komórki białaczki monocytowej THP1	Kontroler ATCC (Kontroler T	TIB-202

SZT. powiedział: