Test znakowania impulsowego bromodeoksyurydyny: technika pomiaru proliferacji komórek

Streszczenie

Źródło: Welschinger R. et al. Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization. J. Vis. Exp. (2015)

Film opisuje stopniowy test znakowania impulsowego komórek ssaków za pomocą bromodeoksyurydyny (BrdU) do pomiaru proliferacji komórek. Wychwyt BrdU pozwala na czasowe śledzenie komórek, które znajdowały się w fazie syntezy w określonym momencie, bez konieczności synchronizacji komórek.

Protokół

1. Roztwory i odczynniki

1. Kompletny RPMI
   1. Dodaj 56 ml płodowej surowicy cielęcej (FCS) i 5,5 ml 200 mM L-glutaminy do 500 ml butelki pożywki RPMI-1640.
2. Roztwór podstawowy BrdU
   1. Przygotować 32,5 mM BrdU (10 mg/ml) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco.
3. BrdU Kompletny RPMI
   1. Dodać 6,2 μl roztworu podstawowego BrdU do 10 ml Complete RPMI.
4. Rozwiązanie DNazy
   1. Przygotować 1 mg DNazy/ml w DPBS.
5. Bufor do barwienia
   1. Przygotować 3% inaktywowany termicznie FCS i 0,09% azydek sodu w DPBS.
6. Zapoznaj się z listą materiałów, aby zapoznać się z definicjami bufora utrwalającego, buforu przepuszczalnego i bufora do płukania.

2. Komórki

UWAGA: Komórki nie były hodowane dłużej niż 6 miesięcy. Metodę tę można bezpośrednio dostosować do każdej nieprzylegającej linii komórkowej z dostosowaniem gęstości komórek i pożywki hodowlanej. Użyj komórek, które rosną wykładniczo na początku eksperymentu.

1. Utrzymuj komórki NALM6 w kolbach hodowlanych T-75 w Complete RPMI. Wszystkie kroki należy wykonywać w sterylnych warunkach, korzystając z komory bezpieczeństwa biologicznego klasy II.
2. Utrzymuj komórki NALM6 między 1-2 x 10⁶ komórek na ml, dzieląc kulturę trzy razy w tygodniu.
3. Inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ w powietrzu.

3. Pulsacyjne znakowanie komórek za pomocą BrdU

UWAGA: Z BrdU należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ jest to potencjalny mutagen i teratogen.

1. Odwirować komórki przy 150 x g przez 5 min.
   nuta: Przeniesienie komórek do świeżej pożywki poprawia powtarzalność wyników.
2. Wykonaj zliczanie komórek i ponownie zawieś komórki w Complete RPMI przy 2 x 10⁶ komórkach/ml.
3. Rozcieńczyć komórki 1 w 2 za pomocą BrdU Complete RPMI, uzyskując końcowe stężenie komórek 1 x 10⁶ komórek/ml.
4. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 45 minut, a następnie rozcieńczyć komórki 1:10 pełnym RPMI. Odwirować komórki o masie 150 x g przez 5 minut i ostrożnie wyrzucić cały supernatant.
5. Ponownie zawieś komórki w małej objętości (~100 μl) pełnego RPMI, wykonaj liczenie komórek i dostosuj do 1 x 10⁶ komórek/ml.
6. Odpipetować 1 ml komórek do dołków płytki 48-dołkowej. Odpipetować 1 ml DPBS do wszystkich wolnych studzienek, aby uzyskać bardziej powtarzalne wyniki.
7. Inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ w powietrzu dla żądanych punktów czasowych, tutaj 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 i 24 godz.
   nuta: Czas trwania będzie zależał od tego, co projekt eksperymentalny ma na celu zmierzyć.
8. Przenieś wszystkie komórki do probówek FACS za pomocą pipety. Przepłukać studzienkę sekwencyjnie objętością 1 ml PBS do końcowej całkowitej objętości 5 ml.
9. Wirować przy 150 x g przez 5 minut i ostrożnie usunąć cały supernatant. Komórki są gotowe do barwienia, wykonaj to natychmiast (sekcja 4).

4. Barwienie komórek

UWAGA: Jeśli wymagane jest barwienie powierzchni komórek, wykonaj je przed utrwaleniem, upewniając się, że komórki są utrzymywane w temperaturze 4 °C przez cały czas.

1. Zawiesić komórki w 100 μl buforu barwiącego (w przypadku opcjonalnego barwienia powierzchniowego dodać zalecaną objętość przeciwciała do antygenów powierzchniowych i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C).
2. Dodać 1 ml buforu barwiącego, wirować przez 5 minut przy 150 x g i odrzucić supernatant.
   Uwaga: Specyficzne przeciwciało, stężenie, czas inkubacji itp. będą się różnić w zależności od konkretnych celów eksperymentalnych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
NALM6	Komunikacja DSMZ	AKUMULATOR ACC-128
5-bromo-2′-deoksyurydyna	Sigma	Zobacz materiał B5002-1G
RPMI 1,640 bez L-Gln 500 ml	Lonza	12-167F
DPBS (Polskie Biuro Obsługi	Lonza	17-512F
Surowica bydlęca płodu	FisherBiotec	FBS-7100113
Inkubator CO2	spoiwo	Zobacz materiał C 150
Rurki BD Falcon 12 x 75 mm FACS	BD Nauki biologiczne	352008
Cytometr przepływowy BD LSR FORTESSA	BD Nauki biologiczne	FORTESSA
wirówka	Spintron (Wirtua	GT-175R

powiedział: Klienta powiedział: powiedział: )