$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Roztwory i odczynniki
- Kompletny RPMI
- Dodaj 56 ml płodowej surowicy cielęcej (FCS) i 5,5 ml 200 mM L-glutaminy do 500 ml butelki pożywki RPMI-1640.
- Rozwiązanie DNazy
- Przygotować 1 mg DNazy/ml w DPBS.
- Bufor do barwienia
- Przygotować 3% inaktywowany termicznie FCS i 0,09% azydek sodu w DPBS.
- Zapoznaj się z listą materiałów, aby zapoznać się z definicjami bufora utrwalającego, buforu przepuszczalnego i bufora do płukania.
2. Barwienie komórek
UWAGA: Jeśli wymagane jest barwienie powierzchni komórek, wykonaj je przed utrwaleniem, upewniając się, że komórki są utrzymywane w temperaturze 4 °C przez cały czas.
- Zawiesić komórki w 100 μl buforu barwiącego (w przypadku opcjonalnego barwienia powierzchniowego dodać zalecaną objętość przeciwciała do antygenów powierzchniowych i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C).
- Dodać 1 ml buforu barwiącego, wirować przez 5 minut przy 150 x g i odrzucić supernatant.
nuta: Specyficzne przeciwciała, stężenie, czas inkubacji itp. będą się różnić w zależności od konkretnych celów eksperymentalnych.
- Utrwalenie i przepuszczalność
- Zawiesić komórki w 100 μl buforu utrwalającego i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
- Dodać 1 ml buforu do przemywania i wirować przez 5 minut przy starciach 150 x g i odrzucić supernatant.
- Zawiesić komórki w 100 μl buforu permeabilacyjnego i inkubować komórki przez 10 minut na lodzie.
- Dodać 1 ml buforu do przemywania i odwirowywać przez 5 minut przy sile 150 x g i odrzucić sklarowany osad.
- Zawiesić komórki w 100 μl buforu utrwalającego na probówkę i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Dodać 1 ml buforu do płukania, odwirowywać przez 5 minut przy 150 x g i odrzucić supernatant.
UWAGA: W razie potrzeby protokół można w tym miejscu wstrzymać. Utrwalone komórki są stabilne przez kilka dni w temperaturze 4 °C, jeśli zostaną ponownie zawieszone w buforze barwiącym. Przed kontynuowaniem usunąć bufor barwiący po odwirowaniu.
- Leczenie DNazy
- Zawiesić komórki w 100 μl roztworu DNazy (30 μg DNazy/106 komórek) i inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
- Dodać 1 ml buforu do przemywania i odwirowywać przy sile 150 x g przez 5 minut i odrzucić sklarowany sklarat nad osadem.
- Barwienie przeciwciałami
UWAGA: Barwienie markerów wewnątrzkomórkowych innych niż BrdU można przeprowadzić jednocześnie z barwieniem BrdU.
- WAŻNE: Przygotuj kontrole kompensacyjne składające się z niebarwionych komórek i komórek znakowanych każdym pojedynczym fluorochromem. Najlepiej użyć tych samych przeciwciał do kontroli kompensacji, co te używane w probówkach eksperymentalnych. Jeśli jednak nie jest to wykonalne, zastąp przeciwciała antygenami o wysokiej ekspresji sprzężonymi z tym samym fluorochromem.
- Ponownie zawiesić komórki w 50 μl buforu do przemywania i dodać 1 μl/106 komórek przeciwciała BrdU.
UWAGA: Można również dodać bezpośrednio sprzężone przeciwciała przeciwko innym specyficznym antygenom wewnątrzkomórkowym.
nuta: Przeciwciała przeciwko histonowi H3 fosforylowane na Ser10 mogą być używane do rozróżniania komórek w G2 i M, histon H3 jest fosforylowany na Ser10 podczas mitozy. Przeciwciała przeciwko cdc2 fosforylowane na Tyr15 mogą być używane do wykrywania komórek, które zobowiązały się do mitozy.
- Inkubować komórki przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
- Dodać 1 ml buforu do przemywania wodą, odwirować komórki o sile 150 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
- Barwienie DNA do analizy cyklu komórkowego
- Poluzować osad i dodać 20 μl roztworu 7-AAD (0,25 μg).
UWAGA: Bardzo ważne jest, aby używać stałej ilości 7-AAD/ogniwo.
- Ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu barwiącego.