Żniwa subpopulacji białaczkowej: metoda przestrzennego oddzielania subpopulacji komórek białaczkowych od kokultury 2D

Abstract

Źródło: Slone, W. L., et al. Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro. J. Vis. Exp. (2016).

Ten film opisuje metodę przestrzennego rozdzielania trzech subpopulacji komórek białaczkowych: zawieszonych komórek białaczkowych swobodnie unoszących się w pożywce, jasnych komórek białaczkowych przylegających do powierzchni monowarstwy komórek mezenchymalnych zrębu oraz komórek białaczkowych ciemnych fazowo, które wyemigrowały pod monowarstwę mezenchymalnych komórek zrębu z kohodowli 2D.

Protocol

1. Wyodrębnienie 3 subpopulacji w ramach kokultury

1. Zbiór subpopulacji guza zawiesiny (S).
   1. Odessać pożywkę z płytki do współhodowli za pomocą pipety i delikatnie ponownie nałożyć tę samą pożywkę, aby przepłukać płytkę i zebrać pożywkę zawierającą komórki białaczkowe w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Pobrane komórki białaczkowe to subpopulacja S.
2. Zbiór subpopulacji guza Phase Bright (PB).
   1. Dodaj 10 ml świeżej pożywki z powrotem na płytkę do wspólnej hodowli. Spłucz energicznie, pipetując dodane media w górę iw dół około 5 razy, aby usunąć przylegające komórki białaczkowe, ale nie na tyle mocno, aby usunąć przylegający składnik BMSC / OB.
   2. Odessać pipetą i zebrać pożywkę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Pobrane komórki stanowią subpopulację PB.
3. Zbiór subpopulacji guza Phase Dim (PD).
   1. Przepłukać płytkę 1 ml PBS w celu usunięcia pozostałego podłoża. Trypsynizować płytkę do jednoczesnej hodowli z 3 ml trypsyny i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 5 minut.
   2. Wyjąć płytkę z inkubatora i delikatnie postukać w boki płytki, aby usunąć przylegający BMSC/OB.
   3. Dodaj 1 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i pipetuj w górę i w dół 3-5 razy, aby rozbić duże agregaty komórkowe.
   4. Zebrać pożywkę z komórkami w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Komórki te są również nieoczyszczoną subpopulacją PD z BMSC / OB.
4. Odwirować 3 izolowane subpopulacje przy 400 x g przez 7 minut. Odessać i wyrzucić supernatant, a następnie ponownie zawiesić granulki w 1 ml wstępnie podgrzanego podłoża. Komórki są gotowe do załadowania do kolumny G10.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml	Produkty medyczne na całym świecie	41021039	Roztwór konserwujący do Próbki cytologiczne
Stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 15 ml	Novacyt	nie	Służy do zbierania komórek
Surowica bydlęca płodu	Sigma	Zobacz materiał F6178
0,05% trypsyna	Mediatech, Inc	5229 TEC 5	25-053-CI
Naczynia do hodowli komórkowych 100 x 20 mm	Greiner Bio-One	Numer katalogowy: 664160
Pożywki hodowlane
Pożywki do hodowli osteoblastów	Komórka promocyjna	Silnik C-27001	Dla ludzkich pożywek osteoblastowych
Nośniki RPMI 1640	Mediatech, Inc.	15-040	Do przygotowania pożywki nowotworowej
Linie komórkowe
Ludzkie osteoblasty	Komórka promocyjna	Nr kat. C-12720	Ludzkie osteoblasty zostały wyhodowane zgodnie z zaleceniami dostawcy.
Ludzkie komórki zrębu kości Morrowa	Rdzeń próbki biologicznej WVU		Zdeidentyfikowane pierwotne komórki zrębu ludzkiej białaczki ludzkiej i komórek zrębu szpiku kostnego (BMSC) zostały dostarczone przez Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core oraz Bank Tkanek Wydziału Patologii Uniwersytetu Zachodniej Wirginii. Hodowle BMSC ustalono zgodnie z wcześniejszym opisem (*)
Komórki białaczkowe
REH	Kontroler ATCC (Kontroler T	ATCC-CRL-8286	Komórki REH hodowano zgodnie z zaleceniami dostawcy i zalecanymi pożywkami.
Zobacz materiał SD-1	Komunikacja DSMZ	ACC 366	SD-1 hodowano zgodnie z zaleceniami dostawcy i zalecanymi pożywkami.