Sortowanie komórek białaczkowych w oparciu o kolumnę G-10: metoda oczyszczania komórek ostrej białaczki limfoblastycznej z komórek zrębu szpiku kostnego

Abstract

Źródło: Slone, W. L., et al. Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro. J. Vis. Exp. (2016).

Ten film opisuje separację komórek ostrej białaczki limfoblastycznej od komórek zrębu szpiku kostnego za pomocą żelowych dziesięciu usieciowanych kolumn dekstranu G-10. Metoda ta pomaga odzyskać populację komórek nowotworowych, które migrowały pod przylegającymi komórkami zrębu szpiku kostnego, generując populację komórek nowotworowych "przyciemnionych fazowo".

Protocol

1. Wczytywanie komórek z kokulturą do kolumny G10

UWAGA: Upewnij się, że zawór jest całkowicie zamknięty przed dodaniem nośnika zawierającego komórki do kolumny G10. Ponadto każda subpopulacja musi być przeprowadzona przez osobną kolumnę G10, aby nie wprowadzać żadnych uprzedzeń między populacjami w dalszej analizie.

1. Za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl dodaj kroplami 1 ml każdej subpopulacji komórek w podgrzanym podłożu do oddzielnej kolumny G10. Upewnij się, że podłoże zawierające ogniwa pozostaje na górze lub w gletach G10. Pozostawić komórki do inkubacji na osadzie G10 przez 20 minut w temperaturze RT.
   nuta: Zawór odcinający pozostaje zamknięty na czas inkubacji.

2. Zbieranie komórek białaczkowych z kolumny G10

1. Dodaj 1-3 ml wstępnie podgrzanego podłoża do każdej kolumny G10. Otwórz zawór odcinający i pozwól, aby media powoli opuszczały kolumnę w kierunku kropli.
   nuta: Bardzo ważne jest utrzymanie powolnego przepływu z kolumny, w przeciwnym razie granulat G10 zawierający BMSC / OB może wypłukać się z kolumny i zanieczyścić izolowane komórki białaczkowe.
2. Kontynuuj dodawanie wstępnie podgrzanej pożywki małymi porcjami (1-2 ml) do kolumny G10, aż łącznie 15 do 20 ml przejdzie przez kolumnę i zostanie zebrane. Zamknij zawór odcinający i rurkę zbiorczą nakrętki.
   nuta: Jeśli na dnie probówki zbiorczej widoczna jest osadka z cząstkami G10, delikatnie usuń pożywkę z probówki, pozostawiając osad cząstek G10 w spokoju i przenieś do nowej probówki.
3. Odwirować zebrane pożywki o stężeniu 400 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w buforze odpowiednim do dalszego zastosowania.
4. Komórki są teraz czystą populacją komórek białaczkowych wolnych od zanieczyszczenia BMSC lub OB i są gotowe do zastosowania w dalszych zastosowaniach według uznania użytkownika.
   UWAGA: Żywotność komórek białaczkowych powinna pozostać niezmieniona podczas przechodzenia komórek przez kolumny G10.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Koraliki sephadex G10	Sigma	Zobacz materiał G10120	Określany w manuskrypcie jako usieciowane cząstki dekstranu w żelu typu 10
10 ml sterylnej strzykawki	Bd	309604
Zawory odcinające 1-drogowe	Światowe instrumenty precyzyjne, Inc.	Numer katalogowy 14054-10
Ludzkie osteoblasty	Komórka promocyjna	Nr kat. C-12720	Ludzkie osteoblasty zostały wyhodowane zgodnie z zaleceniami dostawcy.
Ludzkie komórki zrębu kości Morrowa	Rdzeń próbki biologicznej WVU		Zdeidentyfikowane pierwotne komórki zrębu ludzkiej białaczki ludzkiej i komórek zrębu szpiku kostnego (BMSC) zostały dostarczone przez Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core oraz Bank Tkanek Wydziału Patologii Uniwersytetu Zachodniej Wirginii. Hodowle BMSC ustalono zgodnie z wcześniejszym opisem (*)
0,05% trypsyna	Mediatech, Inc.	25-053-CI
REH	Kontroler ATCC (Kontroler T	ATCC-CRL-8286	Komórki REH hodowano zgodnie z zaleceniami dostawcy i zalecanymi pożywkami
Wełna szklana	Pyrex	3950
Stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml	Produkty medyczne na całym świecie	41021039	Używane jako probówki zbiorcze
Stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 15 ml	Produkty medyczne na całym świecie	41021037	Służy do zbierania komórek
Surowica bydlęca płodu	Sigma	Zobacz materiał F6178
Zobacz materiał SD-1	Komunikacja DSMZ	ACC 366	SD-1 hodowano zgodnie z zaleceniami dostawcy i zalecanymi pożywkami
Naczynia do hodowli komórkowych 100 x 20 mm	Greiner Bio-One	Numer katalogowy: 664160