$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Charakterystyka in vitro linii komórkowej C1498
- Hodowla in vitro komórek C1498
- Przygotuj kompletną pożywkę RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640, dodając 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 ml penicyliny (100 U/ml)-streptomycyny (100 μg/ml), 500 μl 50 mM β-merkaptoetanolu, 5 ml kwasu N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowego (HEPES), 5 ml aminokwasów endogennych i 5 ml pirogronianu sodu do 500 ml pożywki RPMI.
- Rozwijaj linię komórkową C1498 w pełnym RPMI. Pobrać komórki w zawiesinie przez pipetowanie i przenieść komórki do probówki o pojemności 50 ml. Wirować przy 350 x g przez 10 minut i usunąć supernatant.
- Dodać 20 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (1x), odwirować przy 350 x g przez 10 minut i usunąć sklarowany nad osadem.
- Zawiesić komórki w 10 ml buforu sortownika komórek aktywowanego fluorescencją (FAC) (2,5 g albuminy surowicy bydlęcej w proszku (BSA) i 2 ml 0,5 M roztworu kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w 500 ml roztworu PBS). Policzyć komórki za pomocą komory do liczenia komórek Thoma po zabarwieniu komórek błękitem trypanowym.
2. Przygotowanie zawiesiny komórek na szkiełkach do mikroskopii
- Przepłukać 106 zebranych komórek C1498 (otrzymanych w kroku 1.1.4) dwukrotnie 5 ml zimnego buforu FAC i rozcieńczyć komórki w 1 ml zimnego buforu FAC. Umieść probówki na lodzie.
- Umieść szkiełka w jednorazowych komorach z dołączonymi kartami filtracyjnymi i umieść je w cytowirówce.
- Dodać 100 μl buforu FAC do każdej komory i karty filtrującej, a następnie obracać je przez 2 minuty w temperaturze 4,52 x g.
- Dodać 100 μl komórek do każdej komory i karty filtracyjnej, a następnie wirować komórki w temperaturze 4,52 x g przez 2 minuty.
- Ostrożnie wyjmij szkiełka z komór i wysusz je na powietrzu przed zabarwieniem ich bejcą May-Grünwald Giemsa.
3. Barwienie May-Grünwald Giemsa (MGG)
- Wybarwić komórki (przygotowane w punkcie 2), zanurzając szkiełka w słoiku z kopliny zawierającym roztwór Maya-Grünwalda na 3 minuty.
- Przenieś szkiełka do słoika Coplin zawierającego roztwór buforowy o pH 6,8 na 1 minutę.
- Wybarwić szkiełka, umieszczając je w słoiku z kopliny zawierającym roztwór Giemsa R (rozcieńczony do 1/20 w roztworze buforowym o pH 6,8) na 10 minut. Myć szkiełka obojętną wodą (pH 7) przez 10 sekund.
- Odcedź i wysusz szkiełka na powietrzu. Zamontuj szkiełka, nakładając jedną kroplę medium montażowego 2 na ogniwa. Umieść jedną krawędź szkła nakrywkowego na szkiełku podstawowym i ostrożnie opuść je na komórki za pomocą kleszczy. Delikatnie dociśnij szkło nakrywkowe, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.