$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie frakcji subkomórkowych z komórek CLL
UWAGA: Planując przygotowanie eksperymentu, uwzględnij studzienkę z niestymulowanymi/nieleczonymi komórkami, z których można wygenerować ekstrakt z całych komórek.
- Przeprowadzić pożądaną stymulację i/lub leczenie farmakologiczne linii komórkowej CML1 PBL lub izolowanych pierwotnych komórek PBL, używając 10 – 20 x 106 komórek/warunek. Komórki zostaną następnie wykorzystane do frakcjonowania subkomórkowego lub do wygenerowania ekstraktu z całych komórek, jak wyjaśniono poniżej:
- Przygotowanie roztworów/probówek: Przygotować wszystkie roztwory/na świeżo w dniu frakcjonowania, przed pobraniem komórek. Roztwory należy przechowywać na lodzie do momentu, gdy będą potrzebne i zużyć w ciągu 4 godzin od przygotowania.
- Roztwór inhibitora fosfatazy/PBS: Przygotować inhibitory fosfatazy w PBS, rozcieńczając inhibitory fosfatazy w stosunku 1:20 w 1x PBS (tj. 0,5 ml inhibitorów fosfatazy w 9,5 ml 1x PBS).
nuta: Upewnij się, że inhibitory fosfatazy nie wytrąciły się. Jeśli obecny jest osad, podgrzewać do 50 °C przez 10 minut.
- Bufor hipotoniczny: Przygotuj 1x bufor hipotoniczny wykonując rozcieńczenie 1:10 10x buforu hipotonicznego w wodzie destylowanej (tj. 50 μl 10x buforu hipotonicznego na 450 μ l dH2O).
- 10 mM ditiotreitol (DTT): Przygotować 10 mM DTT, rozcieńczając 1M DTT wodą destylowaną w stosunku 1:100 (tj. 10 μL 1 M DTT w 990 μL dH2O).
nuta: Naziemna telewizja cyfrowa jest bardzo labilna, więc za każdym razem przygotuj ją na świeżo. Unikaj powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania.
- Kompletny bufor do lizy: Określ, ile buforu jest wymagane dla każdego eksperymentu. Każda próbka wymaga 50 μl pełnego buforu do lizy, więc dodaj 5 μl 10 mM DTT do 44,5 μl buforu do lizy, a następnie dodaj 0,5 μl koktajlu inhibitorów proteazy. Ilość tę można skalować w górę w zależności od liczby próbek w eksperymencie.
- Oznacz cztery zestawy probówek do mikrofug o pojemności 1,5 ml dla każdej stymulacji i/lub leczenia farmakologicznego dla świeżo stymulowanych komórek, świeżo wygenerowanych frakcji cytoplazmatycznych, świeżo wygenerowanych frakcji jądrowych i lizatów całych komórek. Wstępnie schłodź te rurki do mikrofuge na lodzie, aż będą potrzebne.
- Przenieść komórki do indywidualnie znakowanych probówek do mikrofuge o pojemności 1,5 ml i osadu, wirując przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml lodowato zimnych inhibitorów PBS/fosfatazy. Osadzać komórki przez odwirowanie w sile 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i utrzymać granulki komórek na lodzie.
- Przygotowanie frakcji cytoplazmatycznych: Delikatnie ponownie zawiesić granulki komórkowe, które mają być użyte do frakcjonowania subkomórkowego w 50 μL 1x hipotonicznego buforu. Inkubować komórki na lodzie przez 15 minut, aby umożliwić komórkom pęcznienie.
nuta: Objętość zastosowanego buforu hipotonicznego można zwiększyć empirycznie w zależności od liczby komórek.
- Dodaj 0,8 - 2,5 μl (1:20 do 1:60) detergentu do każdej próbki i wiruj na najwyższym ustawieniu przez 10 sekund.
- Aby określić optymalne stężenie detergentu, który należy zastosować dla określonego typu komórki w celu wyizolowania frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych, należy najpierw wykonać gradient detergentu. Zakres od 1:20 do 1:60 (tj. 2,5 μl do 0,8 μl detergentu w 50 μl buforu hipotonicznego) powinien być wystarczający.
nuta: Jeśli objętość buforu hipotonicznego w kroku 3.4 zostanie dostosowana, upewnij się, że zachowane są odpowiednie proporcje detergentu.
- Sprawdź lizę komórek, obserwując je za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym przed i po dodaniu detergentu. Całe komórki wydają się większe z gęstym, ciemnym jądrem. Cytoplazma pojawi się jako jasne halo wokół jądra.
nuta: Właściwa liza jest dodatkowo potwierdzana przez zastosowanie Western blot do analizy określonych białek w zlizowanych frakcjach generowanych z gradientu detergentu.
- Po lizie próbki należy odwirować w temperaturze 14 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C.
- Ostrożnie przenieść supernatant do wstępnie schłodzonej, oznakowanej probówki do mikrofuge. Ta frakcja cytoplazmatyczna może być przechowywana w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie potrzebna do dalszej analizy. Pozostała osadka zawiera frakcję jądrową.
nuta: Należy unikać powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania próbek.
- Przygotowanie frakcji jądrowych: Zawiesić każdą pastylkę jądrową w 50 μl kompletnego buforu do lizy, pipetując w górę i w dół.
UWAGA: Objętość pełnego buforu do lizy można dostosować empirycznie zgodnie z początkową liczbą komórek.
- Dodać 2,5 μl detergentu, aby rozpuścić białka związane z błoną jądrową i wirować na najwyższym ustawieniu przez 10 s. Próbki inkubować na lodzie przez 30 minut.
- Wirować na najwyższym ustawieniu przez 30 s, a następnie odwirować próbki o stężeniu 14 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
- Przenieść supernatant do wstępnie schłodzonej, oznakowanej probówki do mikrofuge. Ta frakcja jądrowa może być przechowywana w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie potrzebna do dalszej analizy.
nuta: Należy unikać powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania próbek.