1. Przygotowanie odczynników
- Przygotować 500 ml PBS, rozpuszczając 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,47 mM KH2PO4, w ddH2O. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą HCl. Sterylizuj w autoklawie.
- Przygotuj 100 ml pożywki RPMI: pożywki RPMI-1640 z L-alanylo-glutaminą uzupełnioną 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), penicyliną (100 U/ml) i streptomycyną (100 μg/ml).
- Przygotuj 50 ml 0,1 M NaHCO3 w wodzie destylowanej. Ustawić pH do 8,1, wysterylizować filtrem (0,22 μm) i przechowywać w temperaturze 4 °C.
nuta: Na dwie 8-dołkowe płytki analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego przygotuj 250 μl 0,1 M NaHCO3 pH 8,1.
- Przygotuj 1 ml 2 M D-glukozy w wodzie destylowanej. Filtruj sterylizuj (0,22 μm) i przechowuj w temperaturze -20 °C.
- Przygotować 100 μl 1 mM oligomycyny A w etanolu. Filtruj sterylizuj (0,22 μm) i przechowuj w temperaturze -20 °C.
- Przygotować 250 μl 1 M 2-deoksy-D-glukozy (2-DG) w minimalnym DMEM (pożywka Dulbecco's Modified Eagle's). Ogrzać do 37 °C i dostosować pH do 7,4 (przeprowadzić pomiar pH w temperaturze 37 °C). Filtruj sterylizuj (0,22 μm) i przechowuj w temperaturze -20 °C.
- Przygotować 100 μl 1 mM FCCP (cyjanek karbonylu-p-trifluorometoksyfenylohydrazon) w DMSO. Filtruj sterylizuj (0,22 μm) i przechowuj w temperaturze -20 °C.
- Przygotować 100 μl 1 mM rotenonu w etanolu. Filtruj sterylizuj (0,22 μm) i przechowuj w temperaturze -20 °C.
- Przygotować 100 μl 1 mg/ml antymycyny A w etanolu. Filtruj sterylizuj (0,22 μm) i przechowuj w temperaturze -20 °C.
- Tuż przed użyciem przygotuj 10 ml pożywki do testów wysiłkowych glikolizy. Podgrzej minimalny DMEM do 37 °C w łaźni wodnej i dostosuj pH do 7,4 (przeprowadzić pomiar pH w temperaturze 37 °C).
- Przed użyciem należy przygotować 10 ml pożywki do testów warunków skrajnych Cell Mito z BSA. Suplement Minimal DMEM z 2 mM L-glutaminy, 10 mM D-glukozy, 1 mM HEPES (pH 7,4), 1 mM pirogronianu i 0,1% BSA (albumina surowicy bydlęcej). Podgrzać do 37 °C w łaźni wodnej i dostosować pH do 7,4 (przeprowadzić pomiar pH w temperaturze 37 °C).
- Przed użyciem należy przygotować 10 ml pożywki do testów wysiłkowych Cell Mito bez BSA. Uzupełnij Minimalny DMEM o 2 mM L-glutaminy, 10 mM D-glukozy, 1 mM HEPES (pH 7,4) i 1 mM pirogronian. Ciepła pożywka do testów wysiłkowych Mito bez BSA do 37 °C w łaźni wodnej i dostosować pH do 7,4 (przeprowadzić pomiar pH w temperaturze 37 °C).
UWAGA: BSA dodaje się do pożywki do testów warunków skrajnych Cell Mito, ponieważ komórki lepiej reagują na FCCP, gdy pożywka jest uzupełniona BSA (testowano różne warunki). Do załadunku portów używana jest pożywka do testów obciążeniowych Cell Mito bez BSA, ponieważ producent nie zaleca stosowania BSA w medium.
2. Nocna hodowla komórek jednojądrzastych
UWAGA: Wykonaj wszystkie podetapy w sterylnym kapturze do hodowli tkankowej.
- Przygotować dwie kolby T75 z 20 ml RPMI. Do każdej kolby dodać 30 x 106 izolowanych komórek jednojądrzastych. Inkubować komórki w kolbie na stojąco przez 16–24 godziny w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C.
3. Przygotowanie płytek pokrytych klejem komórkowym
- Pokryj dwie 8-dołkowe płytki analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.
nuta: Wykonać powlekanie w sterylnym kapturze do hodowli tkankowych.
- Dodać 2,2 μl kleju komórkowego (gęstość: 2,54 mg/ml) do 250 μl 0,1 MNaHCO3, pH 8,1 i natychmiast odpipetować 12,5 μl roztworu do każdego dołka.
nuta: Roztwory podstawowe kleju komórkowego mogą różnić się gęstością, należy odpowiednio dostosować objętość dodawaną do NaHCO3.
- Pozostaw płytki w kapturze na około 20 minut, a następnie odessaj klej komórkowy i umyj każdą studzienkę dwukrotnie za pomocą 200 μl sterylnej wody. Pozostaw go w okapie z otwartą pokrywą, aż studzienki wyschną.
- Płytki należy zużyć od razu lub zaoszczędzić do 1 tygodnia w temperaturze 4 °C z obrzeżem owiniętym folią parafinową, aby uniknąć kondensacji. Upewnij się, że talerze są rozgrzane do temperatury pokojowej (przez około 20 minut) w okapie przed wysianiem komórek.
4. Nawodnienie wkładu czujnika
UWAGA: Nawodnij dwa 8-dołkowe wkłady analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.
- Oddziel tabliczkę narzędziową i wkład czujnika. Umieść wkład czujnika do góry nogami na stole laboratoryjnym.
- Napełnij każdą studzienkę płytki użytkowej kalibrem 200 μl. Napełnij każdą fosę na zewnątrz studni 400 μl kalibru.
- Umieść wkład czujnika z powrotem na tabliczce znamionowej, która teraz zawiera kaliber.
- Umieść na noc zestaw wkładów w nawilżanym inkubatorze o temperaturze 37 °C bez emisjiCO2
.
- Włącz analizator strumienia zewnątrzkomórkowego i pozwól mu ogrzać się do 37 °C przez noc.
5. Siew komórek w płytkach pokrytych klejem komórkowym
UWAGA: Do testu warunków skrajnych glikolizy użyj podłoża do testów warunków skrajnych glikolizy. Do testu warunków skrajnych Cell Mito należy użyć pożywki do testów warunków skrajnych Cell Mito z BSA.
- Komórki nasienne do testu stresowego glikolizy i testu wysiłkowego Cell Mito na oddzielnych płytkach. Do każdego testu należy użyć komórek z jednej kolby z hodowlą przez noc.
- Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zawieś komórki w 1 ml odpowiedniej pożywki i policz je.
- Dodać 4 x 106 żywych komórek do końcowej objętości 400 μl (użyć odpowiedniego podłoża).
- Płytkę 50 μl zawiesiny komórek do studzienek B-G. Upewnij się, że 500 000 komórek jest wysianych w jednym dołku.
nuta: Bardzo ważne jest, aby wysiać dokładnie 500 000 komórek na studnię, ponieważ nie przeprowadza się żadnej innej normalizacji. W ten sposób można porównać wyniki uzyskane od różnych pacjentów. Optymalna liczba powtórzeń to sześć, jak opisano tutaj. Nie zaleca się stosowania mniejszej liczby powtórzeń, ponieważ komórki pierwotne mogą czasami zachowywać się błędnie.
- Dodać 180 μl odpowiedniej pożywki do studzienek A i H (studzienki te posłużą jako korekta tła).
- Odwirować płytkę o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej z hamulcem ustawionym na 1.
- Powoli i ostrożnie dodać 130 μl odpowiedniej pożywki do studzienek B-G w dwóch 8-dołkowych płytkach analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. Potwierdź wzrokowo, że komórki są stabilnie przylegające do dna studzienek, oglądając je pod mikroskopem.
- Umieścić płytkę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C bez emisjiCO2 w temperaturze 37 °C na 30 minut.
6. Ładowanie wkładu z czujnikiem
- Do testu warunków skrajnych glikolizy przygotuj po 250 μl 100 mM glukozy, 20 μM oligomycyny A i 1 M 2-DG, wszystko w pożywce do testu warunków skrajnych glikolizy.
- Do testu warunków skrajnych Cell Mito przygotuj po 250 μl 20 μM oligomycyny A, 15 μM FCCP, 30 μM FCCP i mieszaninę 10 μM rotenonu i 10 μg/ml antymycyny A, wszystko w pożywce do testów warunków skrajnych Cell Mito bez BSA.
nuta: Zaleca się wstrzyknięcie dwóch stężeń FCCP w jednym teście, ponieważ nie ma wystarczającej ilości materiału pacjenta do miareczkowania FCCP. Niemniej jednak stężenia powinny być określone przez badacza.
- Załaduj związki do odpowiednich portów wtryskiwaczy wkładu w następujący sposób (Tabela 1):
7. Konfiguracja programu
- W przypadku testu warunków skrajnych glikolizy skonfiguruj program zgodnie z opisem w Tabeli 2.
- Na potrzeby testu warunków skrajnych Cell Mito skonfiguruj program zgodnie z opisem w Tabeli 3.
- Uruchom program. Zamień płytkę kalibru na płytkę testową (po wyświetleniu monitu).
| port | Test stresu związanego z glikolizą | Test warunków skrajnych mito komórek |
| Załaduj do portu | Końcowe stężenie w odwiertach | Załaduj do portu | Końcowe stężenie w odwiertach |
| ZA | 20 μL 100 mM glukozy | 10 mM glukozy | 20 μL 20 μM oligomycyny A | 2 μM Oligomycyna A |
| W | 22 μL 20 μM oligomycyny A | 2 μM Oligomycyna A | 22 μL 15 μM FCCP | 1,5 μM FCCP |
| Z | 25 μl z 1 M 2-DG | 100 mM 2-DG | 25 μL z 30 μM FCCP | 4,5 μM FCCP |
| D | Z | | 25 μl 10 μM rotenonu i 10 μg/ml antymycyny A | 1 μM rotenonu i 1 μg/ml antymycyny A |
Tabela 1: Objętości złożone.
| krok | Ustawienia |
| wzorcowanie | Automatyczne |
| Równowagi | Automatyczne |
| Pomiar bazowy | Trzy razy: Wymieszaj – 3 min, Poczekaj – 0 min, Odmierz – 3 min |
| Wtrysk do portu A | zastrzyk |
| pomiar | Trzy razy: Wymieszaj – 3 min, Poczekaj – 0 min, Odmierz – 3 min |
| Wtrysk do portu B | zastrzyk |
| pomiar | Trzy razy: Wymieszaj – 3 min, Poczekaj – 0 min, Odmierz – 3 min |
| Wtrysk portu C | zastrzyk |
| pomiar | Cztery razy: Mieszanie – 3 min, Oczekiwanie – 0 min, Odmierzanie – 3 min |
Tabela 2: Program do testu wysiłkowego glikolizy.
| krok | Ustawienia |
| wzorcowanie | Automatyczne |
| Równowagi | Automatyczne |
| Pomiar bazowy | Trzy razy: Wymieszaj – 3 min, Poczekaj – 0 min, Odmierz – 3 min |
| Wtrysk do portu A | zastrzyk |
| pomiar | Trzy razy: Wymieszaj – 3 min, Poczekaj – 0 min, Odmierz – 3 min |
| Wtrysk do portu B | zastrzyk |
| pomiar | Trzy razy: Wymieszaj – 3 min, Poczekaj – 0 min, Odmierz – 3 min |
| Wtrysk portu C | zastrzyk |
| pomiar | Trzy razy: Wymieszaj – 3 min, Poczekaj – 0 min, Odmierz – 3 min |
| Wtrysk portu D | zastrzyk |
| pomiar | Trzy razy: Wymieszaj – 3 min, Poczekaj – 0 min, Odmierz – 3 min |
Tabela 3: Program do testu warunków skrajnych Cell Mito.
