Wzbogacanie limfocytów T: technika izolowania limfocytów T z mieszanej populacji komórek za pomocą separacji magnetycznej

Streszczenie

Źródło: Nguyen, H. D., et al. Platforma transplantacji szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi. J. Vis. Exp. (2020).

Ten film opisuje wzbogacanie limfocytów T ze śledziony myszy poprzez selekcję negatywną za pomocą separatora magnetycznego. Technika ta polega na ukierunkowaniu na inne komórki w próbce w celu zubożenia za pomocą przeciwciał lub ligandów skierowanych przeciwko określonym antygenom powierzchniowym komórki.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Dzień 1: Przygotowanie limfocytów T od myszy dawcy

1. Użyj myszy typu dzikiego (WT) CD45.2 ⁺ H2k^{b +} C57BL / 6 (WT) jako dawców limfocytów T.
2. Myszy C57BL/6 należy poddać eutanazji przez uduszenie dwutlenkiem węgla (CO₂) i odczekać 2-3 minuty, aż stracą przytomność. W razie potrzeby należy wykonać zwichnięcie szyjki macicy jako wtórną eutanazję.
3. Dokładnie oczyść sierść i skórę myszy 70% etanolem. Wyciąć śledziony i węzły chłonne i rozdzielić je na jednokomórkową zawiesinę splenocytów za pomocą tłoka strzykawki i siatek o wielkości 40 μm. Przemyć sitko i tłok strzykawki 1% RPMI (1% FBS zawierający pożywkę RPMI), aby zebrać wszystkie splenocyty.
4. Odwirować zawiesinę komórek przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Dodać 5 ml buforu lizującego ACK (1 mM Na₂EDTA, 10 mM KHCO₃, 144 mM NH₄Cl, pH 7,2) po odrzuceniu supernatantu. Inkubować zawiesinę komórkową przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   nuta: Bufor do lizy ACK służy do lizy czerwonych krwinek.
5. Dodaj 5 ml 1% RPMI, aby zatrzymać lizę. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
6. Przygotuj lodowaty bufor do sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) (0,5% BSA, 2 mM EDTA w PBS, pH 7,2). Odgazuj bufor przed użyciem. Ponownie zawiesić osady komórek w 5 ml buforu MACS.
7. Policz splenocyty i sprawdź, czy są żywe i martwe komórki za pomocą hemocytometru i 1% błękitu trypanowego. Zapisz podwielokrotność 2 x 10⁶ komórek, aby ocenić wydajność oczyszczania za pomocą analizy cytometrii przepływowej.
8. Zawiesić splenocyty w stężeniu 200 x^{10 6}/ml w buforze MACS. Dodać 0,03 μl biotyny anty-myszy-Ter-119, 0,03 μl biotyny anty-mysiej CD11b, 0,03 μl biotyny anty-myszy-CD45R i 0,03 μl biotyny anty-myszy-DX5 na 10⁶ komórek. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
   nuta: Biotyna anty-mysie-Ter-119, biotyna anty-mysie-CD11b, biotyna anty-mysz-CD45R i biotyna anty-mysz DX5 były używane do reagowania odpowiednio z erytroidami, granulocytami, komórkami B i komórkami NK. W związku z tym te podzbiory komórek są wyczerpywane w następnym kroku.
9. Dodać 10 ml lodowatego buforu MACS do zawiesiny komórek. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
10. Zawiesić osady komórkowe w buforze MACS w stężeniu 100 x 10⁶/ml. Dodaj mikrogranulki antybiotyny (0,22 μL/10⁶ komórek) do zawiesiny splenocytów. Dobrze wymieszać i inkubować przez dodatkowe 15 minut w temperaturze 4 °C. Przemyć zawiesinę komórkową 10 ml lodowatego buforu MACS. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
11. Umieść magnetyczną kolumnę oddzielającą w polu magnetycznym. Przepłukać kolumnę 3 ml buforu MACS. Upuść zawiesinę komórek na kolumnę. Zebrać przepływ składający się z niezwiązanych, wzbogaconych limfocytów T w nowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Przemyć kolumnę MS 3 ml lodowatego buforu MACS.
    nuta: Upewnij się, że kolumna jest pusta przed wykonaniem etapów mycia.
12. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml buforu MACS.
13. Policz komórki w 1% błękitu trypanowego za pomocą hemocytometru. Zachowaj podwielokrotność 2 x 10⁶ komórek do kontroli czystości za pomocą cytometrii przepływowej.
    nuta: Średnia wydajność limfocytów T śledziony wyizolowanych tą metodą wynosi ~20−25 x 10⁶ komórek na mysz.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Silnik RPMI 1640	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy 11875-093	media
Komputery MidiMACS	Miltenyi Biotec	Numer katalogowy: 130-042-302	Wzbogacanie limfocytów T
0,5 M EDTA pH 8,0 100ML	Fisher Naukowy	BP2482100	Bufor MACS
10 razy więcej kanałów na sekundę	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP3994	Bufor MACS
Mikrogranulki antybiotynowe	Miltenyi Biotec	Numer katalogowy: 130-090-485	Wzbogacanie limfocytów T
Anty-Człowiek/Myszy CD45R (B220)	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 13-0452-85	Wzbogacanie limfocytów T
Biotyna przeciw myszom CD4	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 13-0041-86	Wzbogacanie limfocytów T
Płyta CD11b	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 13-0112-85	Wzbogacanie limfocytów T
CD25-biotyna	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 13-0251-82	Wzbogacanie limfocytów T
Płyta CD45R	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 13-0452-82	Wzbogacanie limfocytów T
CD49b Przeciwciało monoklonalne (DX5)-biotyna	Thermo Fisher Naukowy	13-5971-82	Wzbogacanie limfocytów T
Anty-mysz TER-119 Biotyna	Thermo Fisher Naukowy	13-5921-85	Wzbogacanie limfocytów T
Anty-mysz CD45.1 PE	Thermo Fisher Naukowy	12-0900-83	Analiza cytometrii przepływowej
Myszy C57BL/6	Rzeka Karola	27 Rozdział 27	Darczyńcy/Biorcy
Rurki do cytometrii przepływowej	Fisher Naukowy	352008	Analiza cytometrii przepływowej
Sitko do komórek 40 uM	Thermo Fisher Naukowy	22363547	Przygotowanie komórek