Generowanie komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego: metoda generowania komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy

1. Generuj komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego (BM-DCs).

1. Odizoluj szpik kostny od kości udowych i piszczelowych myszy WT lub czynnika B (fB)^-/- na tle B6. Krótko mówiąc, zbierz kość piszczelową i kość udową z obu nóg za pomocą kleszczy i nożyczek. Umieść je w lodowatym RPMI zawierającym 1% FCS i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny i 2 mM L-glutaminy (1% RPMI) w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Dokładnie oczyść kość udową i piszczelową, usuwając wszystkie tkanki mięśniowe za pomocą kleszczy i nożyczek. Przenieść kość udową i piszczelową z probówek stożkowych o pojemności 50 ml na szalkę Petriego o średnicy 92 mm zawierającą 1% RPMI. Za pomocą nożyczek odetnij końce kości udowej lub piszczelowej. Napełnij probówkę o pojemności 50 ml 25 ml pożywki 1% RPMI 1640. Użyj tego, aby napełnić strzykawkę o pojemności 3 ml dołączoną do igły 26 G 3 ml 1% RPMI. Włożyć tę strzykawkę do kości i wcisnąć tłok, aby wypłukać szpik kostny (BM) z jamy do probówki zbiorczej z 1% RPMI (~3 ml/kość). Wiruj komórki w temperaturze 800 x g przez 5 minut.
2. Zawiesić osad w 5 ml buforu lizującego ACK w celu lizy krwinek czerwonych. Inkubować zawiesinę komórkową przez 5 minut na lodzie. Dodać 10 ml 1% RPMI do zawiesiny komórek, aby zatrzymać lizę i odwirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
3. Zawiesić osady komórkowe w 10 ml pożywki hodowlanej (RPMI 1640 zawierającej 10% FBS, 100 U/ml penicyliny/streptomycyny, 2 mM l-glutaminy i 50 mM β-merkaptoetanolu) i dostosować objętość, aby osiągnąć końcowe stężenie 2 x 10⁶ komórek/ml.
4. Dodać 20 ng/ml czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) do zawiesiny komórkowej. Hodować komórki szpiku kostnego na szalkach Petriego o wymiarach 100 x 15 mm w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ przez 6 dni.
5. Zastąp połowę trwających pożywek hodowlanych (około 5 ml) świeżymi pożywkami zawierającymi 40 ng/mL GM-CSF w dniu 3.
6. Podgrzej pożywkę hodowlaną w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Zebrać około 5 ml pożywki z szalek do hodowli szpiku kostnego. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w pożywce hodowlanej o pojemności 5 ml zawierającej 40 ng/ml gm-csf.
7. Dodać 25 μg/ml lipopolisacharydu (LPS) do pożywki w 6. dniu hodowli, aby dojrzeć BM-DC. Zapisz podwielokrotność 2 x 10⁶ komórek, aby określić skuteczność różnicowania DC za pomocą cytometrii przepływowej.
8. Zbierz dojrzałe BM-DC: Użyj podnośników komórkowych, aby delikatnie zeskrobać DC z szalek Petriego. Zebrać wszystkie zawiesiny komórek w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Odwirować przy 800 x g, przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Umyj granulki komórek 3x 50 ml lodowatego PBS. Zaoszczędź około 2 x 10⁶ BM-DC do immunologicznej analizy fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej.