Ścinanie chromatyny: metoda generowania fragmentów chromatyny za pomocą trawienia enzymatycznego

Streszczenie

Źródło: Fuchs, A. R. et al. A Test immunoprecypitacji chromatyny w celu identyfikacji nowych genów docelowych NFAT2 w przewlekłej białaczce limfocytowej. J. Vis. Exp.(2018).

Ten film opisuje protokół ścinania chromatyny za pomocą trawienia enzymatycznego nukleazy mikrokokowej. Ścinanie chromatyny jest niezbędnym krokiem w immunoprecypitacji chromatyny lub przepływie pracy ChIp, który pomaga badać interakcję białko-DNA w ludzkich komórkach przewlekłej białaczki szpikowej. W protokole funkcji ścinanie chromatyny odbywa się za pomocą sonikacji.

Protokół

1. Utrwalenie, liza komórek i ścinanie chromatyny

UWAGA: Próbki pacjentów i komórki Jurkat są utrwalane i poddawane lizie za pomocą dostępnego na rynku zestawu ChIP zgodnie z instrukcjami producenta z modyfikacjami opisanymi wcześniej. Mocowanie odbywa się pod okapem z przepływem laminarnym.

1. Przygotuj probówkę o pojemności 1,5 ml z 1 ml 37% formaldehydu, probówkę o pojemności 1,5 ml z 1 ml 1,25 M glicyny, probówkę o pojemności 5 ml z 4 ml 1x PBS i pudełko z lodem do utrwalenia komórek.
2. Po stymulacji komórek przez odpowiedni czas inkubacji, Stymuluj komórki, dodając 32,4 nM 12-mirystynianu 13-octanu (PMA) i 1 μM jonomycyny. Następnie inkubować komórki przez 16 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przy otwartej pokrywie probówki (w celu uniknięcia zanieczyszczenia można użyć folii uszczelniającej przepuszczającej powietrze, obracać probówki 5 ml przy 200 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić komórki w 500 μl PBS w probówkach 5 ml.
3. Dodaj 340 μM formaldehydu (13,5 μl 37% formaldehydu) do komórek. Po krótkim wymieszaniu przez staranne pipetowanie w górę i w dół, inkubować zawiesinę przez 2,5 minuty (komórki Jurkata) lub 5 minut (próbka pacjenta) w temperaturze pokojowej.
   nuta: Wydłużony czas wiązania jest potrzebny komórkom pierwotnym, aby zapewnić optymalne ścinanie.
4. Dodać 125 mM glicyny (57 μl z 1,25 M glicyny), aby zatrzymać utrwalanie i inkubować przez kolejne 5 minut. Natychmiast po tym umieścić komórki na lodzie i odwirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant przez aspirację.
5. Przemyć komórki dwukrotnie 1 ml lodowatego PBS o stężeniu 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i za każdym razem usunąć supernatant przez aspirację.
   nuta: Po fiksacji protokół może zostać wstrzymany. Stałe ogniwa należy przechowywać w temperaturze -80 °C. W celu zbadania, czy epitop przeciwciała przeznaczonego do użycia w poniższym protokole nie jest zamaskowany przez utrwalenie, dodatkowe próbki można wykorzystać do analizy za pomocą elektroforezy żelowej SDS-PAGE i Western blot. Czynności te wykonuje się przy użyciu 100 μg białka zgodnie z instrukcjami producenta. Wszystkie przeciwciała αNFAT2 stosuje się w rozcieńczeniu 1:1000, a przeciwciało GAPDH w rozcieńczeniu 1:10000. Przykładowy obraz utrwalonych próbek z komórek Jurkata z odpowiednimi i nieodpowiednimi przeciwciałami przedstawiono na rycinie 1.
6. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml dostępnego w handlu buforu do lizy 1, pipetując w górę iw dół. Następnie umieść próbki na lodzie na wytrząsarce i inkubuj je przez 10 minut, wytrząsając.
   nuta: Przed lizą komórki mogą być rozpadane przez 10 s w ciekłym azocie. Jest to przydatne w przypadku komórek Jurkata, ale należy tego unikać w pierwotnych próbkach pacjentów. W celu rozpadu umieść probówki o pojemności 5 ml na 5 s w 5-10 ml ciekłego azotu w specjalnym pojemniku. Nosić okulary ochronne i odpowiednie rękawice ochronne.
7. Następnie odwirować probówki o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie usunąć supernatant przez pipetowanie.
8. Homogenizować komórki w 5 ml dostępnego w handlu buforu do lizy 2, pipetując w górę i w dół, a następnie inkubować przez 10 minut na lodzie, wytrząsając. Następnie odwirować probówki o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie usunąć supernatant przez pipetowanie.
9. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl (komórki Jurkat) lub 140 μl (próbki pacjenta) buforu ścinającego 1 zawierającego 1x inhibitor proteazy (odpowiednio 5 μl lub 1,4 μl) i inkubować mieszaninę przez 10 minut na lodzie.
10. W przypadku ścinania chromatyny należy przenieść 140 μl zawiesiny komórek z kroku 1.9 do probówek sonikatora (unikać wytwarzania pęcherzyków powietrza i powtórzyć ten krok, jeśli jest to konieczne ze względu na objętość próbki). Umieścić probówki w zogniskowanym ultrasonografie w temperaturze 7 °C i ścinać przez 10 minut (linia komórkowa) lub 7,5 minuty (próbki pacjenta) ze średnią mocą padającą 9,375 W, aby uzyskać fragmenty DNA o wartości 200-500 pz.
11. Na koniec odwirować w temperaturze 15700 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w małej wirówce i zebrać supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
12. Aby sprawdzić odpowiednie rozmiary fragmentów, przeanalizuj 20 μl ściętej chromatyny za pomocą elektroforezy żelowej w 1,5% żelu agarozowym TBE. Przykładowy obraz ściętej chromatyny z komórek Jurkata dobrej i złej jakości przedstawiono na rycinie 2. W tym momencie protokół może zostać potencjalnie wstrzymany. Chromatyna ścięta powinna być przechowywana w temperaturze -80 °C.

Wyniki

Rycina 1: Przykłady działania przeciwciał w utrwalonych komórkach Jurkata oceniane za pomocą SDS-PAGE i Western-Blot. (a) Komórki Jurkata utrwalono na 0 minut (pasma A i D), 2,5 minuty (pasma B i E) lub 5 minut (C i F) i porównano αprzeciwciało NFAT2 (klon 7A6) różnych producentów (pasma A-C = producent 1, pasma D-F = producent 2). Przeciwciało producenta 1 w...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
37 % Formaldehyd rocznie, ACS	Roth	4979.1
1 x PBS	Sigma Aldrich	Zobacz materiał D8537
Wytrząsarka do probówek 1,5 ml Themomixer comfort	Eppendorf	5355 000.011	Może być zastąpiony podobnymi instrumentami
M220 Skoncentrowany ultrasonograf	Współżylaki	500295
20X Bolt MES SDS Bufor do biegania	Thermo Scientific	B0002
Sól fizjologiczna buforowana Tris (TBS-10X)	Sygnalizacja komórkowa	#12498
iBlot 2 Urządzenie do przenoszenia żelu	Thermo Scientific	IB21001
iBlot 2 Stosy transferowe, nitroceluloza, rozmiar regularny	Thermo Scientific	Zobacz materiał B23001
duża wirówka	Eppendorf	Zobacz materiał 5804R	Może być zastąpiony podobnymi instrumentami
Probówka DNA LoBind 1,5 ml	Eppendorf	22431021
Koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy Halt (100X)	Thermo Scientific	Numer telefonu 78440
Mała wirówka	Thermo Scientific	Fresk Heraeusa 17
Gradient gęstości średni Biocoll (Gęstość 1,077 g/ml)	Merck	L 6115