Test immunoprecypitacji chromatyny: technika badania interakcji białko-DNA w komórkach

Streszczenie

Źródło: Fuchs, A. R., et al. Test immunoprecypitacji chromatyny w celu identyfikacji nowych genów docelowych NFAT2 w przewlekłej białaczce limfocytowej. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film opisuje protokół testu immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), który jest klasyczną techniką demonstracji interakcji białko-DNA. Technika ta służy do identyfikacji docelowych genów w ludzkich komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej.

Protokół

1. Immunoprecypitacja chromatyny

UWAGA: Immunoprecypitacja chromatyny została przeprowadzona za pomocą dostępnego na rynku zestawu ChIP zgodnie z instrukcjami producenta z modyfikacjami.

1. Obliczyć liczbę immunoprecypitacji (70 μl (komórki Jurkata) lub 15 μl (próbki pacjenta) ściętej chromatyny plus jedno przeciwciało) i przygotować 20 μl kulek pokrytych białkiem A na wytrącenie w probówce o pojemności 1,5 ml. Przemyć kulki w 40 μl 1x buforu ChIP 1 na wytrącenie, pipetując w górę i w dół, pozostawić kulki w stojaku magnetycznym na 1 minutę i usunąć supernatant przez pipetowanie. Wykonaj ten krok w sumie cztery razy. Na koniec ponownie zawieś koraliki w oryginalnym woluminie za pomocą 1x bufora ChIP 1.
2. Do samej immunoprecypitacji należy użyć 10 μg przeciwciała αNFAT2 (7A6) do wychwycenia NFAT2 wraz z jego związanymi sekwencjami docelowymi. Użyj 2,5 μg króliczego przeciwciała IgG (DA1E) jako kontroli IgG. Przygotować reakcje w świeżych probówkach o pojemności 1,5 ml, jak wskazano w tabeli 1.
   UWAGA: Ważne jest, aby użyć przeciwciała monoklonalnego o wysokim powinowactwie, którego epitop nie jest maskowany podczas fiksacji dla tego protokołu. Przeciwciała poliklonalne wprowadzają dodatkowy poziom zmienności, co znacznie utrudnia właściwą interpretację otrzymanych wyników.
3. Inkubować mieszaninę z etapu 1.2 przez noc w temperaturze 4 °C na obracającym się kole z prędkością 6 obr./min.
4. Następnego dnia wirować probówki przez 5 s przy 7 000 x g w małej wirówce, inkubować je w stojaku magnetycznym przez 1 minutę i usunąć supernatant przez aspirację. Umyj koraliki raz każdym z myjących 1, 2, 3 i 4 po kolei.
5. W tym celu należy ponownie zawiesić kulki w 350 μl buforu do przemywania i inkubować je przez 5 minut w temperaturze 4 °C na obracającym się kole z prędkością 6 obr./min.
6. Następnie wirować probówki przez 5 s przy 7000 x g w małej wirówce. Następnie umieść je na 1 minutę w stojaku magnetycznym, usuń supernatant i dodaj kolejny bufor do płukania.
7. Po ostatnim etapie płukania usunąć supernatant za pomocą pipetowania, zebrać kulki w 100 μl buforu elucyjnego 1 i inkubować je przez 30 minut na obracającym się kole z prędkością 6 obr./min.
8. Krótko zakręć probówkami (5 s przy 7000 x g w małej wirówce) i umieść je w stojaku magnetycznym na 1 minutę.
9. Następnie przenieść supernatant przez pipetowanie do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i dodać 4 μl buforu elucyjnego 2.
10. Aby utworzyć kontrolę wejściową, zmieszaj 1 μl ściętej chromatyny z 99 μl buforu elucyjnego 1 i 4 μl buforu elucyjnego 2 (w tej konfiguracji na pacjenta przypadają trzy probówki: jedna kontrolna wejściowa, jedna kontrolna IgG i jedna próbka αNFAT2).
11. Próbki inkubować przez 4 godziny w temperaturze 65 °C i prędkości obrotowej 1300 obr./min w wytrząsarce probówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 100 μl 100% izopropanolu, wirować i wirować próbki przez 5 s przy 7000 x g w małej wirówce.
12. Ponownie zawiesić dostępne kulki magnetyczne poprzez dokładne wirowanie, dodać 10 μl kulek do każdej próbki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na obracającym się kole z prędkością 6 obr./min.
13. Po inkubacji wirować probówki przez 5 s przy 7000 x g w małej wirówce i umieścić je na 1 minutę w stojaku magnetycznym. Usunąć supernatant przez aspirację.
14. Zawiesić kulki w 100 μl buforu do przemywania 1. Odwróć probówki do wymieszania i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej na obracającym się kole z prędkością 6 obr./min.
15. Wirować probówki przez 5 s przy 7000 x g w małej wirówce, umieścić je na 1 minutę w stojaku magnetycznym i usunąć supernatant przez pipetowanie. Powtórz kroki 2.13-2.14 z buforem płuczącym 2.
16. Następnie usunąć bufor płuczący przez aspirację, ponownie zawiesić kulki w 55 μl buforu elucyjnego i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej na obracającym się kole z prędkością 6 obr./min w celu wymycia wytrąconego DNA. Na koniec wirować probówki przez 5 s przy 7000 x g w małej wirówce, umieścić je na 1 minutę w stojaku magnetycznym i przenieść supernatant do nowych probówek o pojemności 1,5 ml.
    nuta: W tym miejscu protokół może zostać potencjalnie wstrzymany. Wyluzowany DNA należy następnie przechowywać w temperaturze -20 °C.

szt.

przedmiot	objętość (μl) na IP
5% BSA	6
100 x inhibitor proteazy	3
5 x bufor ChIP 1	56 Rozdział 56
Chromatyna ścinana	x (15 μL lub 70 μL)
Koraliki magnetyczne powlekane białkiem A	20
Woda klasy ChIP seq	185-x-y
przeciwciało (αNFAT2 lub kontrola IgG)	y (1,09 μl lub 1 μl)
łączny	270

Tabela 1: Harmonogram pipetowania immunoprecypitacji chromatyny. Immunoprecypitację chromatyny przeprowadzono poprzez przygotowanie reakcji zgodnie z tabelą.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przeciwciało anty-NFAT2	Alexis	1008505	Klon 7A6
Przeciwciało anty-NFAT2	Sygnalizacja komórkowa	Zobacz materiał 8032S	Klon D15F1
Przeciwciało anty-NFAT2 klasy ChIP	Księga Abcam	ab2796 powiedział	Klon 7A6
Stojak magnetyczny, DynaMag-15 Magnes	Thermo Scientific	Numer katalogowy 12301D	Może być zastąpiony podobnymi instrumentami
Zestaw iDeal ChIp-seq do histonów	Diagenoda	C01010059
Mała wirówka	Thermo Scientific	Fresk Heraeusa 17	Może być zastąpiony podobnymi instrumentami
Shakerka Duomax 1030	Instrumenty Heidolpha	543-32205-00	Może być zastąpiony podobnymi instrumentami
Koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy Halt (100X)	Thermo Scientific	Numer telefonu 78440
IRDye 680LT IgG przeciw królikom osłom (H + L), 0,5 mg	LI-COR Nauki biologiczne	926-68023
IRDye 800CW Kozia anty-mysia IgG (H + L), 0,1 mg	LI-COR Nauki biologiczne	925-32210
Probówka DNA LoBind 1,5 ml	Eppendorf	22431021
FBS superior	Merck	S0615
37 % Formaldehyd rocznie, ACS	Roth	4979.1
1 x PBS	Sigma Aldrich	Zobacz materiał D8537
M220 Skoncentrowany ultrasonograf	Współżylaki	500295
20X Bolt MES SDS Bufor do biegania	Thermo Scientific	B0002
Sól fizjologiczna buforowana Tris (TBS-10X)	Sygnalizacja komórkowa	#12498
iBlot 2 Urządzenie do przenoszenia żelu	Thermo Scientific	IB21001
iBlot 2 Stosy transferowe, nitroceluloza, rozmiar regularny	Thermo Scientific	Zobacz materiał B23001
duża wirówka	Eppendorf	Zobacz materiał 5804R	Może być zastąpiony podobnymi instrumentami

: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: