Hodowla i zbiór klonów HSPC: metoda uzyskiwania pojedynczo sortowanych klonów HSPC

Streszczenie

Źródło: Huber, A. R., et al. Charakterystyka ładunku mutacyjnego i składu klonalnego ludzkiej krwi. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film opisuje protokół izolowania HSPC ze szpiku kostnego i sortowania ich za pomocą techniki fluorescencyjnie aktywowanego sortowania komórek, która jest metodą uzyskiwania pojedynczo sortowanych HSPC. Hodujemy te posortowane komórki, aby uzyskać klony HSPC.

Protokół

1. Izolacja, sortowanie i kultura HSPC

1. Wirować w 1–2 x 10⁷ komórek jednojądrzastych przez 5 minut przy 350 x g i ponownie zawiesić w 50 μl buforu FACS. Zawiesić osad komórkowy w 100 μl roztworu barwiącego anty-CD3 (rozcieńczenie przeciwciała anty-CD w buforze FACS w stosunku 1:100). Przenieść komórki do probówki do mikrowirówki.
   UWAGA: Podczas sortowania z komórkami >2 x 10⁷ należy odpowiednio zwiększyć objętość mieszaniny przeciwciał i buforu FACS.
2. Przygotować 50 μl 2x mieszanki barwiącej HSC zgodnie z recepturą przedstawioną w Tabeli 1
3. Zmieszać 50 μl roztworu komórkowego z przygotowaną mieszanką barwiącą HSC i inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT) lub przez 1 godzinę na lodzie w celu związania przeciwciał.
4. Przemyć komórki, dodając 1 ml buforu FACS i osadu, wirując przez 5 minut przy 350 x g.
5. Ponownie zawiesić komórki w 300 μl buforu FACS i przefiltrować zawiesinę komórek przez 35 μm rurkę polistyrenową o pojemności 5 ml z sitkiem o pojemności 5 ml, aby usunąć grudki komórek przed sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją (FACS).
6. Przygotować 25 ml pożywki hodowlanej HSPC, składającej się z 1x pożywki SFEM uzupełnionej 100 ng/ml SCF, 100 ng/ml Flt3, 50 ng/ml TPO, 10 ng/ml IL-3, 20 ng/mL IL-6 i 100 ng/ml preparatu antybiotykowego (patrz tabela materiałów).
7. Wypełnij 384-dołkową płytkę do hodowli komórkowych 75 μl pożywki hodowlanej HSPC w każdym dołku.
   UWAGA: Aby zapobiec parowaniu pożywki w dołkach zewnętrznych, należy napełnić zewnętrzne studzienki 75 μl sterylnej wody lub PBS i nie używać tych studzienek do sortowania komórek.
8. Sortowanie pojedynczych HSPC
   1. Ustaw bramki do sortowania HSPC w oparciu o niebarwioną kontrolę (pojedynczo posortowane HSC) i 10 000 komórek z barwionej próbki. Reprezentatywny wynik dla ustawiania bramek przedstawiono na rysunku 1. Bramkowanie pojedynczych komórek poprzez narysowanie bramki wokół liniowej frakcji wysokości FSC w funkcji obszaru FSC. Użyj niebarwionej frakcji kontrolnej, aby narysować bramkę ^{dla frakcji} rodowodu. Narysuj bramki dla komórek CD34 ⁺ i dalej scharakteryzuj ten podzbiór^, ustawiając specyficzną bramkę dla komórek CD38-CD45RA.
   2. Załaduj płytkę 384-dołkową na maszynę FACS i posortuj pojedyncze komórki.
      UWAGA: Jeśli ma to zastosowanie do maszyny FACS, włącz opcję zachowania danych sortowania indeksów, aby umożliwić ponowne śledzenie posortowanych komórek.
9. Hodowla pojedynczo sortowanych HSC
   1. Bezpośrednio przenieść płytkę 384-dołkową do nawilżonego inkubatora o temperaturze 37 °C z 5% CO₂,
      nuta: Aby zapobiec parowaniu podczas hodowli, owiń płytkę hodowlaną 384 dołków (z pokrywką) przezroczystą folią polietylenową.
   2. Trzymaj płytkę 384 dołków w inkubatorze przez 3-4 tygodnie, aż pojawią się widoczne klony. Reprezentatywne obrazy kultury klonalnej przedstawiono na rycinie 2. W zależności od stanu materiału wejściowego, 5%–30% posortowanych komórek rozszerzy się klonalnie.

pkt.

przeciwciało	objętość [μL]
BV421-CD34	5
FITC-Lineage mix (CD3/14/19/20/56)	5
PE-CD38	cyfra arabska
Pakiet APC-CD90	0,5
PerCP/Cy5.5 - CD45RA	5
PE/CY7- CD49f	1
FITC -CD16	1
FITC-CD11	5
Bufor FACS	25,5

Tabela 1: Mieszanka sortowania HSC.Pokazano tabelę wskazującą rozcieńczenia przeciwciał stosowanych do sortowania HSC.

2. Zbieranie klonów HSPC

1. Po 4 tygodniach hodowli określ, które studnie mają zbieg 30% lub wyższy.
2. Wstępnie napełnij (dla każdego wyrostka klonalnego) 1,5 ml mikroprobówek 1 ml 1% BSA w PBS i oznacz probówkę zgodnie z odpowiednim dołkiem.
3. Wstępnie zwilż końcówkę pipety 1% BSA w PBS, aby zminimalizować liczbę komórek przyklejających się do końcówki pipety.
4. Pipetować w górę/w dół pożywki w studzience gwałtownie (co najmniej 5 razy) za pomocą pipety o pojemności 200 μl (ustawionej na 75 μl) i zeskrobać dno studzienki, aby poluzować komórki w studzience, a następnie zebrać zawiesinę komórek w oznakowanej mikroprobówce odpowiadającej studzience.
5. Pobrać 75 μl świeżego 1% BSA do PBS i powtórzyć pipetowanie w studzience, aby zapewnić maksymalny wychwyt komórek.
   UWAGA: Komórki hodowane klonalnie mogą przyklejać się do dna studni. Sprawdź studzienki za pomocą standardowego mikroskopu ze światłem odwróconym, aby upewnić się, czy wszystkie komórki zostały zebrane.
6. Jeśli wszystkie studzienki o zbiegu >30% zostały zebrane, umieść płytkę 384 dołków z powrotem w inkubatorze. Kultury klonalne mogą rozmnażać się do 5 tygodni.
7. Wirować zawiesinę komórek przez 5 minut w temperaturze 350 x g. Powinna być widoczna mała granulka.
8. Ostrożnie usunąć wszystko, z wyjątkiem około 5 μl supernatantu. Granulki komórkowe można zamrażać w temperaturze -20 °C i przechowywać przez wiele miesięcy przed izolacją DNA.

Wyniki

Rysunek 1: Schemat blokowy przedstawiający procedurę eksperymentalną opartą na materiale wejściowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysu...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
CD11c FITC	Legenda biologiczna	301603	Klon 3.9
CD16 FITC	Legenda biologiczna	302005	Klon 3G8
CD3 BV650	Legenda biologiczna	300467	Klon UCHT1
CD34 BV421	Legenda biologiczna	343609	Okręg wyborczy 561
CD38 PE	Legenda biologiczna	303505	Klon HIT2
CD45RA PerCP/Cy5.5	Legenda biologiczna	304121	Klon HI100
CD49f PE/CY7	Legenda biologiczna	313621	Klon GoH3
Transporter opancerzony CD90	Legenda biologiczna	328113	Klon 5E10
Sitko do komórek 5 ml probówka	Corning	352235
Płyta CELLSTAR, 384w, 130 μL, F-bottom, TC, pokrywa	Greiner	781182
Ludzki Flt3-Ligand, klasa premium	Technologia biologiczna Miltenyi	Numer katalogowy: 130-096-479	Rozpuszczony w jednorazowych podwielokrotnościach (25 μl) w stężeniu 100 μg/ml w 0,1% powierzchni ciała w PBS
Ludzka rekombinowana IL-3 (z ekspresją E. coli)	Technologie komórek macierzystych	78040.1	Rozpuszczony w jednorazowych podwielokrotnościach (2,5 μl) w stężeniu 100 μg/ml w 0,1% powierzchni ciała w PBS
Ludzka rekombinowana IL-6 (z ekspresją E. coli)	Technologie komórek macierzystych	78050.1	Odtworzyć w podwielokrotnościach jednorazowego użytku (5 μl) w stężeniu 100 μg/ml w 0,1% BSA w PBS
Ludzki SCF, klasa premium	Technologia biologiczna Miltenyi	Numer telefonu 130-096-695	Rozpuszczony w jednorazowych podwielokrotnościach (25 μl) w stężeniu 100 μg/ml w 0,1% powierzchni ciała w PBS
Ludzkie TPO, klasa premium	Technologia biologiczna Miltenyi	130-095-752	Odtworzyć w jednorazowych podwielokrotnościach (12,5 μl) w stężeniu 100 μg/ml w 0,1% powierzchni ciała w PBS
Pochodzenie (CD3/14/19/20/56) FITC	Legenda biologiczna	348701	Klony: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56
Pbs			Wyprodukowano w placówce Instytutu. Można również korzystać z dostępnych komercyjnie PBS
Primocin	Szczepionka Invivogen	ANT-PM-1	Preparat antybiotykowy

TGL powiedział: