$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
Izolacja komórek c-Kit+ ze szpiku kostnego
- Złóż myszy w ofierze zgodnie z wytycznymi instytucji.
UWAGA: W tym przypadku myszy były wystawione na działanie dwutlenku węgla (CO2) przy zalecanym natężeniu przepływu zgodnie z AVMA, dopóki śmierć nie została określona przez zaprzestanie oddychania i bicia serca, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
- Zbierz kości nóg myszy - dwie kości udowe, dwie piszczele, dwa biodrowe. Oczyść wszystkie tkanki z kości, zeskrobując je skalpelem. Umieść kości nóg w zimnym 1x PBS na lodzie — 5 ml w probówce 15 ml. Wlej zawartość probówki do moździerza i zmiażdż ją tłuczkiem.
- Przefiltrować zawiesinę komórek przez sitko o pojemności 70 μm do probówki z nakrętką o pojemności 50 ml z dołączoną pipetą o pojemności 10 ml za pomocą pipety. Umyj moździerz i tłuczek wiele razy zimnym 1x PBS, zbierając i dodając zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 50 ml. Wirować szpik kostny w temperaturze 1 200 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min. Usunąć supernatant za pomocą podciśnienia z dołączoną szklaną pipetą. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml 1x PBS za pomocą pipety.
- Za pomocą pipety powoli dodaj zawieszony szpik kostny do wierzchu 5 ml polisarozy o temperaturze pokojowej (temperatura jest krytyczna), uważając, aby nie naruszyć interfejsu. Wirować przy 400 x g w temperaturze pokojowej przez 20 minut przy wyłączonym hamulcu.
- Zebrać mętną powierzchnię styku całkowitej komórki jednojądrowej (TMNC) za pomocą pipety i umieścić ją w nowej probówce o pojemności 15 ml. Zwiększyć objętość do 10 ml za pomocą 1x PBS do prania, biorąc 20 μl do liczenia i wirować w temperaturze 1 200 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant i zachować osad na lodzie do kroku 4.6.1.
- Wykonaj izolację komórek c-Kit+.
- Postępuj zgodnie z protokołem zestawu mikrokulek do izolacji komórek c-Kit+. Zawiesić osad komórkowy w 80 μl 1x PBS + EDTA + BSA do 107 komórek. Do zawiesiny komórek dodać 20 μl mikrokulek CD117 / 107 komórek ogółem. Dobrze wymieszać przez wirowanie i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Doprowadzić objętość do 10 ml dodając 1x PBS + EDTA + BSA i wirować w temperaturze 1 200 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
- Usunąć supernatant za pomocą próżni i zawiesić osad komórek w 500 μl / 10 łącznie8 komórek w 1x PBS + EDTA + BSA. Za pomocą stojaka magnetycznego z dołączoną kolumną magnetyczną dodaj 3 ml 1x PBS + EDTA + BSA i pozwól mu przepłynąć grawitacyjnie do probówki zbiorczej o pojemności 15 ml.
- Gdy pierwszy dodatek buforu zakończy przechodzenie przez kolumnę, dodaj zawiesinę komórek do kolumny, umożliwiając jej przepływ grawitacyjny do probówki zbiorczej o pojemności 15 ml. Ten przepływ jest niepożądaną frakcją komórkową.
- Przemyć kolumnę 3 razy 3 ml 1x PBS + EDTA + BSA za każdym razem, pozwalając jej przepływać grawitacyjnie do probówki zbiorczej. Wyjmij kolumnę z magnesu i umieść ją na górze probówki o pojemności 15 ml.
- Dodać 5 ml 1x PBS + EDTA + BSA i natychmiast przepłukać je tłokiem dostarczonym z kolumną. Zdjąć tłok i powtórzyć płukanie z dodatkowymi 5 ml 1x PBS + EDTA + BSA. Policz komórki w całkowitej objętości przy użyciu standardowych metod.
- Wirować komórki w temperaturze 1 200 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w pełnym IMDM (IMDM + 10% FBS + IL-6 [10 ng/ml] + mSCF [50 ng/ml] + ligand FLT3 [20 ng/mL] + IL-3 [10 ng/ml]) do hodowli. Hodować te komórki przez noc w 2 x 10 6 komórek/1 ml kompletnej pożywki komórkowej IMDM, umieszczając je w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .