Transdukcja za pośrednictwem retrowirusa: metoda wprowadzania genu docelowego do komórek rakowych

Streszczenie

Źródło: Kesarwani, M., et al. Metody oceny roli c-FOS i Dusp1 w zależności od onkogenu. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film opisuje protokół walidacji genetycznej poprzez transfer docelowych genów za pomocą retrowirusów w liniach komórkowych przewlekłej białaczki szpikowej. Retrowirusy działają jako mediator w przenoszeniu materiału genetycznego do komórki białaczkowej w procesie zwanym transdukcją, który umożliwia długotrwałą ekspresję genu docelowego. Metodę tę można zastosować do dowolnych komórek docelowych w celu walidacji genetycznej i opracowania terapeutycznego.

Protokół

1. Transdukcja

1. Transfekcja plazmidu retrowirusowego
   1. Świeżo rozmrożone komórki HEK293 poprzedniego popołudnia w łaźni wodnej nastawionej na 37 °C. Wirować krioprobówkę zawierającą komórki HEK pod ciśnieniem 435 x g w temperaturze pokojowej przez 3 minuty. Usunąć supernatant za pomocą próżni i zawiesić osad komórkowy w 1 ml DMEM uzupełnionym 10% FBS, penicyliną, streptomycyną i glutaminą.
   2. Policz komórki i dodaj odpowiednią objętość do naczynia poddanego działaniu 10 cm (~4 x 10⁶ HEK293T komórek). Dodaj 14 ml pożywki DMEM 10 do naczynia i dobrze wymieszaj, przesuwając w górę iw dół, aby uzyskać równomierne rozprowadzenie. Umieść naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 na} noc.
   3. Następnego ranka sprawdź zbieganie się komórek pod mikroskopem odwróconego światła (50% lub więcej działa dobrze).
   4. Połączyć DNA (pożądany plazmid retrowirusowy), PclEco (plazmid pakujący), 2 M CaCl₂ i H₂0 w probówce o pojemności 1,5 ml (= 500 μl) za pomocą mikropipety w następujących ilościach: 7,5 μg DNA (BCR-ABL1-YFP), 7,5 μg pCLeco, 62 μL 2 M CaCl₂ i wodę do końcowej objętości 500 μL. Dodaj 500 μL 2x HBS do kolejnej probówki 1,5 ml. Dodaj 500 μL 2x HBS do kolejnej probówki 1,5 mL.
   5. Dodaj mieszaninę DNA kroplami do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 μl 2x HBS (280 mM NaCl, 100 mM HEPES i 1,5 mM Na₂HPO₄) podczas mieszania. Osiągnij to, ustawiając wir na najniższą prędkość i przytrzymując na nim rurkę HBS w celu ciągłego mieszania podczas dodawania mieszanki transfekcyjnej.
   6. Pozostaw mieszankę transfekcji do inkubacji przez 20–30 minut w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji dodać 25 nM chlorochiny do komórek HEK i umieścić je z powrotem w inkubatorze. Po inkubacji dodawać mieszaninę do transfekcji kroplami do komórek HEK, a następnie delikatnie zamieszać pożywkę, aby wymieszać mieszankę transfekcyjną na całej płytce.
   7. Inkubować komórki z mieszanką przez ~8 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 .} Zmień pożywkę na tych komórkach, bardzo powoli dodając 14 ml świeżej pożywki DMEM 10. Powolne dociskanie do ścianki naczynia pomaga zapobiec usuwaniu komórek HEK. Inkubować komórki przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 .}
   8. Zebrać supernatant wirusa za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml, pobrać supernatant do strzykawki i założyć filtr strzykawkowy 0,45 μm. Zanurz wirusowy supernatant w nowej probówce do pobrania. Weź pierwszy zbiór wirusowego supernatantu ~16 godzin później.
2. Koncentracja i transdukcja wirusa fibronektyny
   1. Dodaj 2 ml rekombinowanego fragmentu ludzkiej fibronektyny o stężeniu 0,1 mg w 1x PBS do nieleczonych 6-dołkowych płytek hodowlanych. Przygotuj tyle fibronektyny, ile potrzeba, w zależności od liczby komórek i genotypów. Jedna studnia może wystarczająco wydusić 10 milionów komórek c-Kit+. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 4 °C.
   2. Następnego dnia wyjmij fibronektynę z dołków za pomocą pipety, odpipetuj 2 ml sterylnego 2% BSA w 1x PBS, aby zablokować płytkę, i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Wyjmij BSA za pomocą odkurzacza i dokładnie umyj, pipetując 2 ml 1x PBS, a następnie wyjmij go za pomocą próżni
   .
   3. Natychmiast dodać świeżo zebrany i przefiltrowany (przy 0,45 μm) supernatant wirusowy do 5 ml. Wirować przy 435 x g w temperaturze 32 °C przez 2 godziny. Usunąć supernatant za pomocą próżni i powtórzyć ten krok z dodatkowym świeżo zebranym supernatantem wirusowym i ponownie odwirować. Usunąć supernatant za pomocą próżni i umyć studzienki, dodając 2 ml 1x PBS; Następnie usuń go za pomocą odkurzacza.
   4. Dodaj komórki myszy c-Kit +, które były hodowane przez noc, obracając komórki w dół i ponownie zawieszając osad w pełnym IMDM do hodowli. Hodować te komórki przez noc w 2 x 10^{6 komórek/}1 ml kompletnej pożywki komórkowej IMDM, umieszczając je w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 )} do dołków pokrytych wirusem, dobrze mieszając zawiesiny komórek i pipetując je do teraz wirusowej skoncentrowanej płytki fibronektyny. Wirować w temperaturze 1 200 x g w temperaturze 25 °C przez 90 min. Umieść komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2.
   5. 48 godzin po transdukcji, osadzać komórki przez odwirowanie w temperaturze 1 200 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i ponownie zawiesić je w buforze FACS #1 (1x PBS + 0,5% BSA) do 6 x 10⁶/ml. Określ procent komórek dodatnich BCR-ABL1, mierząc procent dodatnich komórek YFP za pomocą cytometrii przepływowej.
   6. Pobieranie zdarzeń za pomocą standardowej procedury. Najpierw bramkuj żywe komórki na podstawie rozproszenia do przodu i z boku. Następnie bramkują żywe komórki YFP dodatnie, z wyłączeniem komórek YFP-ujemnych określonych przez kontrolę ujemną (ryc. 1).

Wyniki

Rycina 1: FACS pokazująca częstość komórek YFP+ z krwi przeszczepionej myszy i myszy WT (kontrola ujemna). Górne panele pokazują wykres punktowy komórek i bramkowania. Dolne panele pokazują histogramy YFP w stosunku do rozproszenia bocznego. Komórki z MFI >10³ uznano za YFP+. Podobne bramkowanie zastosowano dla komórek szpiku kostnego ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM (DMEM)	Cellgro (corning)	15-013-CV
Rekombinowany fragment ludzkiej fibronektyny retronektyny	Takara	Zobacz materiał T100B
FBS (Sieć Usługowa	Biologiczny w Atlancie	S11150
Penn/Paciorkowiec	Cellgro (corning)	30-002-CI
L-glutamina	Cellgro (corning)	25-005-CL	5 mg/ml zapasu w wodzie
HEPESY	Sigma	Zobacz materiał H7006
Pbs	Corning	21040CV
Na2HPO4.7H2O	Sigma	Zobacz materiał S9390
Chlorek wapnia	Invitrogen	K278001
2x HBS	Invitrogen	K278002
Edta	Ambion	AM9261
Bsa	Sigma	A7906
Długotrwała hodowla ludzka inicjująca test komórkowy	Technologie ogniw Stemp
Automatyczny licznik komórek TC-10	Szczepionka Bio-RAD
ROSACreERT2/c-Fos fl/fl Dusp1-/-	Wyprodukowano we własnym zakresie
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl	Wyprodukowano we własnym zakresie
ROSACreERT2	Laboratorium Jacksona
Zobacz materiał C57Bl/6	Laboratorium Jacksona
Komórki CML-CD34+ i normalne CD34+	Szpital Uniwersytecki, Uniwersytet w Cincinnati
LSR II (analizator FACS)	Bd
Fortessa I (analizator FACS)	Bd
FACSAriaII (Sorter FACS)	Bd
Inkubator CO2 NAPCO serii 8000 WJ	Termo naukowy
Łyżka obrotowa z wirnikiem cetrifuge 5810R	Eppendorf
1/2 cc Strzykawka insulinowa Lo-Dose u-100 28 G1/2	Becton Dickinson	Becton Dickinson
Hydrokortyzon Hemibursztynian sodu	Technologie komórek macierzystych	Numer telefonu 7904
GM-CSF (Instrument Zarządzania Mózgowo-T	Prospec	CYT-221
G-SCF	Prospec	CYT-220
Człowiek IL-3	Prospec	CYT-210
ludzki SCF	Prospec	CYT-255
Erytropoeteina	Amgen	Nr kat. 5513-267-10
BD Perm/Wash (roztwór do permeabilizacji i przemywania dla przepływu fosfonu)	Bd	554723
BD Cytofix/Cytoperm (roztwór utrwalający i przepuszczalny)	Bd	554714
BD Pharm Lize	Bd	555899
Gwiezdny ogniwo nylonowe 70 μm	Becton Dickinson	Numer katalogowy: 352350
Filtr dyskowy acro 0,45 μM	Pall	2016-10

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: