Test CFU na bazie metylocelulozy: metoda określania wpływu związków przeciwnowotworowych na tworzenie kolonii w komórkach białaczkowych

Streszczenie

Źródło: Kesarwani, M., et al. Metody oceny roli c-FOS i Dusp1 w zależności od onkogenu. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film opisuje protokół dla jednostki tworzenia kolonii na bazie metylocelulozy lub testu CFU, który pomaga zidentyfikować i policzyć liczbę kolonii utworzonych przez komórki białaczkowe w odpowiedzi na leczenie związkami przeciwnowotworowymi.

Protokół

1. Testy jednostek tworzących kolonie

1. Rozmrażać metylocelulozę z cytokinami dla myszy w temperaturze pokojowej przez 1–2 godziny. Podacz 3 ml metylocelulozy w probówce FACS za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml bez igły. Posortuj komórki z dodatnim wynikiem YFP w sortowniku komórek.
2. Zakręć ogniwami w dół i zawieś osad w kompletnym nośniku IMDM. Policz komórki do posiewu i rozcieńcz je, aby uzyskać 5,000 komórek YFP-dodatnich w 100 μl kompletnej pożywki IMDM.
3. Dodać 100 μl zawiesiny komórkowej zawierającej 5 000 komórek YFP-dodatnich i odpowiednich inhibitorów do 3 ml metylocelulozy. Wiruj na haju, aby mieszać przez 10–30 sekund.
4. Po ucieczce większości pęcherzyków powietrza użyj strzykawki o pojemności 1 ml do podania 1 ml podłoża na trzech powtórzonych płytkach o średnicy 3 cm, wyrzucając pożywkę z jednej strony i powoli przechylając płytkę ruchami okrężnymi, aby równomiernie się rozprowadzić.
5. Końcowe stężenie stosowanych inhibitorów to imatynib w stężeniu 3 μM, DFC w stężeniu 0,2 μM i BCI w stężeniu 0,5 μM, pojedynczo lub w skojarzeniach. Tam, gdzie jest to właściwe, usunąć c-Fos poprzez posiew komórek z 4-hydroksytamoksyfenem (1 μg/ml) dodanym do metylocelulozy.
6. Po posianiu umieść płytki na dużej szalce Petriego z jednym otwartym naczyniem zawierającym 2 ml sterylnej wody pośrodku. Przykryć dużą szalkę Petriego i ostrożnie inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 .} Zapisz liczbę kolonii po tygodniu posiewu, licząc całkowitą liczbę kolonii pod mikroskopem.
7. Przeanalizuj kilka kolonii z odpowiednich płytek pod kątem delecji c-Fos metodą PCR. Zbierz kolonie, ssąc je końcówką P1000. Usuń komórki w 500 μl 1x PBS, wielokrotnie myjąc końcówkę w PBS. Wiruj zawiesiny komórek w temperaturze 6 000 x g przez 1 minutę i wyekstrahuj DNA z osadu komórkowego za pomocą zestawu do izolacji genomowego DNA.
8. Użyj genomowego DNA do PCR przy użyciu starterów mFos-FP3 i mFos-RP5. Przeanalizuj produkty PCR na 2% żelu agarozowym i zobrazuj za pomocą systemu dokumentacji żelu.
9. Aby uzyskać graficzną prezentację kolonii, zabarwić je za pomocą chlorku jodonitrotetrazoliowego. Rozpuścić 10 mg chlorku jodonitrotetrazolu w 10 ml wody, aby otrzymać roztwór o stężeniu 1 mg/ml. Filtr wysterylizować roztwór za pomocą śluzki Luer z filtrem 0,2 μm podłączonym do strzykawki o pojemności 10 ml w sterylnych warunkach w kapturze do hodowli tkankowych.
10. Do okapu do hodowli tkankowej dodać kroplami 100 μl roztworu barwiącego wokół płytki CFU; należy uważać, aby nie przesunąć ani nie naruszyć kolonii. Inkubować płytki przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Kolonie zmienią kolor na ciemnoczerwono-brązowy. Używając białego tła w sterylnym kapturze do hodowli tkankowej, zrób zdjęcia poplamionej płytki CFU.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
IMDM (Międzynarodowa Organizacja Zarządzania	Cellgro (corning)	15-016-CVR
MethoCult GF M3434 (metyloceluloza do jtku myszy)	komórka macierzysta	3434
4-hydroksytamoksyfen	Sigma	Zobacz materiał H6278
Rekombinowany mysi SCF	Prospec	CYT-275
Rekombinowany mysi Flt3-ligand	Prospec	CYT-340
Rekombinowana mysia IL-6	Prospec	CYT-350
Rekombinowana mysia IL-7	Peprotech	217-17
Dfc	LKT Laboratories Inc.	Zobacz materiał D3420
BCI (Certyfikat BCI	Chemzon Naukowy	NZ-06-195
Imatynib	Laborator LC	I-5508
1x PBS (Biblioteka PBS)	Cellgro (corning)	21-040-CV
1/2 cc Strzykawka insulinowa Lo-Dose u-100 28 G1/2	Becton Dickinson	329461
Chlorek jodonitrotetrazolu	Sigma	I10406
Instrumentów
Inkubator CO2 NAPCO serii 8000 WJ	Termo naukowy
Łyżka obrotowa z wirnikiem cetrifuge 5810R	Eppendorf
C-1000 Termocykler	Szczepionka Bio-RAD
ChemiDoc Imaging System (system obrazowania żeli i plam zachodnich)	Szczepionka Bio-RAD	17001401
Myszy
ROSACreERT2	Laboratorium Jacksona
ROSACreERT2/c-Fos fl/fl Dusp1-/	Wyprodukowano we własnym zakresie
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl	Wyprodukowano we własnym zakresie