Negatywna selekcja immunomagnetyczna: metoda oczyszczania limfocytów B z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej

Abstract

Źródło: Serra S. et al. Test oparty na HPLC do monitorowania zewnątrzkomórkowego metabolizmu nukleotydów/nukleozydów w ludzkich komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej. J. Vis. Exp. (2016)

Film wyjaśnia sposób oczyszczania limfocytów B poprzez celowanie immunomagnetyczne i separację od zawiesiny komórek jednojądrzastych krwi obwodowej. Metoda ta polega na znakowaniu niepożądanych typów komórek specyficznymi przeciwciałami lub ligandami (połączonymi z cząstkami magnetycznymi) skierowanymi przeciwko określonym białkom powierzchniowym komórki, które mają zostać usunięte z heterogenicznej zawiesiny komórkowej przez separację magnetyczną.

Protocol

1. Oczyszczanie białaczkowych komórek B przez negatywną izolację

1. Zawiesić 10⁷ PBMCs/ml w PBS 0,1 % albuminy surowicy bydlęcej (BSA) 2 mM EDTA, pH 7,4 (bufor izolacyjny).
2. Dodać 10 μg mysich przeciwciał monoklonalnych anty-CD3, -CD14 i -CD16 dla^10-7 komórek i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
3. Przemyć komórki buforem izolacyjnym i odwirować w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
4. Zawiesić komórki w buforze izolacyjnym przy^10-7 PBMCs/ml.
5. Przed inkubacją z komórkami należy ponownie zawiesić owcze kulki magnetyczne anty-mysie IgG w fiolce. Przenieś 100 μl kulek na 10⁷ komórek do probówki.
6. Dodać 1 ml buforu izolacyjnego i umieścić probówkę w uchwycie magnetycznym na 1 minutę. Odrzucić supernatant za pomocą pipety o pojemności 5 ml.
7. Wyjmij rurkę z magnesu i ponownie zawieś umyte kulki w 100 μl buforu izolacyjnego.
8. Inkubować 10-7 komórek ze 100 μl kulek magnetycznych przez 30 minut w temperaturze 4 °C, delikatnie przechylając i obracając.
9. Umieścić probówkę w uchwycie magnetycznym na 2 minuty i przenieść supernatant z niezwiązanymi komórkami CD19⁺/CD5⁺ do świeżej probówki za pomocą pipety o pojemności 5 ml.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Krew ludzka
oczyszczony anty-CD3, -CD14, -CD16	Wykonane we własnym zakresie		mysz monoklonalna
Dynabeads owce anty-mysie IgG	Invitrogen	Numer katalogowy: 11031
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Amresco (angielski)	E404-200KARTY	Tabletki
albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Życiorys identyfikacyjny	1000-70	Gatunek standardowy
Bufor izolacyjny			PBS 0,1% BSA 2 mM EDTA, pH 7,4
Magnes DynaMag-15	Invitrogen	Numer katalogowy 12301D	Magnetyczny separator kulek Dynal