Mikrodysekcja tkanek embrionalnego oka rybki zebrafish

Podsumowanie

Niniejszy artykuł opisuje metodę mikrodyssekcji siatkówek zebrafish (danio pręgowanego) z dołączonym lub usuniętym nabłonkiem barwnikowym siatkówki, z embrionów od jednego do trzech dni po zapłodnieniu.

Streszczenie

Danio pręgowany jest popularnym modelem zwierzęcym w badaniach nad rozwojem oka ze względu na jego szybkiex uterorozwój oraz wysoka płodność. Do 3 dni po zapłodnieniu (dpf) larwy wykazują pierwszą reakcję wzrokową. Zidentyfikowano wiele genów kontrolujących prawidłowy rozwój oka, jednak wciąż jesteśmy daleko od pełnego zrozumienia leżącej u podstaw architektury genetycznej. Profilowanie ekspresji genów w całym genomie jest użytecznym narzędziem do wyjaśnienia sieci regulacji genetycznej rozwoju oka. Jednak niewielki rozmiar zarodkowego oka u rybek zebrafish sprawia, że uzyskanie nienaruszonych i czystych tkanek oka do analizy ekspresji jest trudne. Na przykład długość przednio-tylna oka między 2. a 3. dniem wynosi zaledwie około 200-300 μm, podczas gdy średnica soczewki jest mniejsza niż 100 μm. Ponadto nabłonek barwnowy siatkówki (RPE) znajdujący się pod siatkówką jest tylko nabłonkiem jednowarstwowym. Chociaż profile ekspresji genów można uzyskać z całego zarodka, nie odzwierciedlają one dokładnie ekspresji w tych konkretnych tkankach. Dlatego w celu skutecznego profilowania ekspresji genów w rozwoju oka konieczne jest uzyskanie czystej tkanki. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy metodę mikrodysekcji nienaruszonej siatkówki oraz siatkówki z przytwierdzonym RPE w okresie od 1 do 3 dpf, co obejmuje główne etapy morfogenezy oka. Wszystkie procedury można przeprowadzić przy użyciu precyzyjnych pęset i ogólnego wyposażenia laboratoryjnego pod standardowymi stereomikroskopami. W przypadku dysekcji siatkówki, jednowarstwowy RPE jest usuwany i odrywany poprzez ruch omiatający oraz dzięki preferencyjnej adhezji pozostałości RPE do powierzchni płytki hodowlanej służącej do dysekcji. W przypadku dysekcji siatkówki z przytwierdzonym RPE, adhezja RPE do płytki dysekcyjnej jest usuwana przed przystąpieniem do zabiegu, dzięki czemu RPE może zostać w całości zachowany wraz z siatkówką. Ostrożne uniesienie tej tkanki pozwala na efektywne oddzielenie domniemanej ciała naczyniowej i twardówki. Soczewkę w obu przypadkach można usunąć za pomocą chemicznie trawionej igły wolframowej. Podsumowując, nasza metoda pozwala na uzyskanie nienaruszonych tkanek oka i została z powodzeniem wykorzystana do badania specyficznych dla tkanki profili ekspresji siatkówki rybek zebrafish^{1, 2}i nabłonek barwnowy siatkówki³Empty source HTML. No content to translate.

Protokół

Część 1: Przygotowania przed mikrodysekcją

1. Roztwory
   1. pożywka E3⁴ (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl₂ oraz 0.33 mM MgSO₄).
   2. roztwór Ringera^{1, 5} (116 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂, 5 mM HEPES, pH7.2), sterylizowany przez filtrację.
   3. 5N NaOH.
2. Trawienie chemiczne igieł wolframowych
   1. Zabezpieczyć mały zlew z 5N NaOH na szalce Petriego za pomocą glinki.
   2. Przymocować spinacz biurowy do boku zlewka tak, aby stykał się z roztworem NaOH.
   3. Podłączyć elektrodę ujemną z zasilacza DC do spinacza, a elektrodę dodatnią do jednego końca krótkiego odcinka (~2cm) drutu wolframowego.
   4. Owinąć drugi koniec drutu wolframowego małą kuleczką glinki i zanurzyć ten koniec w roztworze NaOH.
   5. Zwiększyć napięcie do około 3V i zanurzać drut w górę i w dół w roztworze NaOH, aż do uzyskania odpowiedniej prędkości trawienia. Igłę wysokiej jakości można zazwyczaj wytrawić w ciągu 10 minut.
   6. Drut wolframowy wystawiony na działanie roztworu będzie stopniowo cieńszy. W momencie odpadnięcia kuleczki glinki, druga strona drutu, która nadal jest przymocowana do elektrody dodatniej, będzie miała kształt ostrej igły.
   7. Przepłukać ostrą igłę roztworem Ringera lub pożywką E3, aby usunąć osady soli.
   8. Przymocować igłę do drewnianego aplikatora za pomocą taśmy lub uchwytu do igieł w celu ułatwienia manipulacji.
3. Płytki hodowlane
   1. Polistyrenowe płytki hodowlane Falcon 60 x 15 mm są gotowe do użycia w mikrodysekcji siatkówki.
   2. W celu wycięcia siatkówki przylegającej do RPE, na 30 minut przed dysekcją całkowicie rozgnieść dwa embriony w płytce hodowlanej zawierającej roztwór Ringera, aby zniwelować lepkość powierzchni. Tuż przed dysekcją dokładnie wypłukać płytkę świeżym roztworem Ringera.
4. Zbiór i etapowanie embrionów
   1. Dorosłe danio pręgowane są utrzymywane zgodnie z opisem^{4, 5}.
   2. W noc poprzedzającą rozród rozdzielić ryby rodzicielskie w statycznych zbiornikach hodowlanych parami za pomocą przegrody.
   3. Usunąć przegrodę następnego ranka po włączeniu światła w pomieszczeniu. Pozwolić rodzicom na krzyżowanie się w 10-minutowych odstępach co pół godziny. Rozdzielać ryby po każdym krzyżowaniu.
   4. Embriony zebrane z każdego krzyżowania utrzymywać oddzielnie w pożywce E3 w temperaturze 28°C.
   5. Etapować embriony w 10 do 12 godzin po zapłodnieniu (hpf) i ponownie etapować bezpośrednio przed dysekcją w określonych punktach czasowych, zgodnie z ustalonymi kryteriami^{1, 6}.

Część 2: Disekcja – usunięcie mózgu i odsłonięcie oczu¹

• Procedury opisane w tej sekcji są wspólne dla preparowania siatkówki (Część 3A) oraz siatkówki z przytwierdzonym nabłonkiem barwnikowym (RPE) (Część 3B).
• Wszystkie precyzyjne etapy preparowania są wykonywane za pomocą końcówki pęsety Dumont, z wykorzystaniem drugiej pęsety Dumont do pozycjonowania tkanki. W razie potrzeby do bardziej precyzyjnych manipulacji można użyć chemicznie trawionej igły wolframowej.
• Wszystkie precyzyjne etapy preparowania są wykonywane przy powiększeniu ~ 5-8x pod mikroskopem Olympus SZX16 wyposażonym w obiektyw 1X lub odpowiednik.
• Zarodki należy utrzymywać w medium E3 w inkubatorze laboratoryjnym w temperaturze 28°C obok mikroskopu, aby zapewnić łatwy dostęp do nich podczas preparowania.
• Stolik mikroskopu jest podgrzewany do 28°C za pomocą płyty termicznej, aby zminimalizować wpływ wahań temperatury na ekspresję genów.

1. Przenieś embrion na określonym etapie rozwoju do roztworu Ringera w płytce hodowlanej Falcon 60 x 15 mm przygotowanej zgodnie z opisem w części 1#3.
2. Szybko odetnij głowę wraz z częścią przedniego tułowia od reszty ciała.
>
3. Przymocuj tylny koniec tej tkanki do płytki hodowlanej za pomocą pęsety pomocniczej.
4. Otwórz głowę od strony grzbietowej, zaczynając od przedniej części czoła.
5. Usuń mózg w taki sposób, aby przyśrodkowa strona oczu została odsłonięta i była skierowana do góry w celu dalszych manipulacji.

Część 3A: Disekcja siatkówki¹

1. Przygotować zarodek zgodnie z opisem w Części 2.
2. Ostrożnie przesuwać końcówką pęsety po odsłoniętym RPE na stronie przyśrodkowej gałki ocznej skierowanej ku górze, aż do momentu zauważenia niewielkiego otworu w siatkówce.
3. Kontynuować szczotkowanie i odwarstwianie, aż strona przyśrodkowa siatkówki zostanie niemal całkowicie odsłonięta. Należy unikać zadrapiania i przebijania odsłoniętej siatkówki.
4. Aby usunąć boczny RPE z siatkówki, która znajduje się teraz stroną dolną do dołu, należy przystąpić do zabiegu pod kątem około 45° względem powierzchni płytki hodowlanej.
5. Usunąć RPE, który jest stosunkowo mocno przyczepiony do ora serrata, przytwierdzając oddzieloną część RPE do płytki hodowlanej w celu dissekcji, a następnie delikatnie unieść siatkówkę.
6. Przetaczać siatkówkę po dnie naczynia hodowlanego, aby oczyścić ją z pozostałości RPE.
   1. Zauważono, że ta konkretna polistyrenowa płytka hodowlana Falcon wykazuje preferencyjną adhezję RPE przez około 20 minut po zmiażdżeniu zarodka. Właściwość ta jest wykorzystywana do usuwania resztek RPE. Jednakże komórki siatkówki również przylegają do powierzchni w mniejszym stopniu, co można dokładnie sprawdzić pod dużym powiększeniem. Należy zachować równowagę między całkowitością usunięcia RPE a integralnością siatkówki.
   2. Soczewka często przylega do płytki hodowlanej i oddziela się od siatkówki podczas procesu przetaczania. Sporadycznie konieczne jest oddzielenie soczewki za pomocą trawionej igły wolframowej, wykonując koliste ruchy na powierzchni soczewki.
7. Procedury te pozwalają na skuteczne usunięcie RPE z siatkówki bez naruszania integralności tkanki. Wskazuje na to dobra ogólna morfologia (Rysunek 1B i B') oraz histologia (Rysunek 1B"). W szczególności wyjątkowo dobrze zachowana jest macierz zewnątrzkomórkowa pomiędzy warstwą fotoreceptorów a RPE (Rysunek 1B", strzałka; porównać z histologią całego zarodka (Rysunek 1A")).

Część 3B: Disekcja siatkówki z przytwierdzonym nabłonkiem barwnikowym (RPE)³

1. Przygotować embrion zgodnie z opisem w części 2.
2. Przymocować głowę do płytki hodowlanej za pomocą pincety pomocniczej. Delikatnie unieść oko od strony bocznej tylnej i przetoczyć je w stronę przednią.
   1. Tkanka przypuszczalnej błony naczyniowej i twardówki znajdująca się na zewnątrz warstwy RPE przylega stosunkowo ściśle do skóry i może zostać w większości oddzielona poprzez ostrożne przetoczenie oka w stronę przednią.
3. Usunąć soczewkę za pomocą igły wolframowej po odsłonięciu bocznej strony oka, gdy oko jest nadal przymocowane do skóry.
4. Procedury te pozwalają na skuteczne zachowanie całej warstwy RPE wraz z siatkówką. Tkanki przypuszczalnej błony naczyniowej i twardówki można w znacznym stopniu usunąć (Rysunek 1C, C' i C").

Część 4: Pobieranie próbek tkanek do analizy RNA

1. Wypreparowane próbki można zebrać w odczynniku TRIzol w probówce mikrocentryfugowej wolnej od RNaz w celu późniejszej charakterystyki RNA, zgodnie z wcześniejszym opisem¹.

Reprezentatywne wyniki

Rycina 1. (A) Widok boczny i (A') grzbietowy głowy larwy danio pręgowanego w 52 hpf przed sekcją. (A") Odpowiadający przekrój histologiczny głowy larwy z (A) i (A'). (B) Widok boczny i (B') grzbietowy wypreparowanej siatkówki w 54 hpf. Powierzchnia siatkówki pozostała nienaruszona zarówno w widoku bocznym, jak i grzbietowym. (B") Odpowiadający przekrój histologiczny wypreparowanej siatkówki z (B) i (B'). Struktura siatkówki oraz jej laminacja były zachowane. W szczególności macierz pozakomórkowa między warstwą fotoreceptorów a RPE (A", strzałki) była dobrze zachowana w wypreparowanej siatkówce (B", strzałki). (C) Widok boczny i (C') przyśrodkowy wypreparowanej siatkówki z przytwierdzonym RPE w 52 hpf. Warstwa RPE była nienaruszona i ciągła, co potwierdził również przekrój histologiczny wypreparowanej tkanki (C"). Biały obszar w C' to nerw wzrokowy (strzałka). Do badań histologicznych pobrano próbki tkanek i utrwalono je w 4% paraformaldehydzie. Zatapianie w plastiku i krojenie tych próbek wykonano zgodnie z opisem³. Pasek skali = 50 μm.

Dyskusja

Mikrodysekcja tkanek oka danio pręgowanego pozwala na skuteczne pozyskanie nienaruszonych siatkówek oraz siatkówek z przytwierdzonym nabłonkiem barwnikowym siatkówki (RPE). Znacznie ułatwia to badania ekspresji dotyczące konkretnej tkanki oka (tj. siatkówki lub RPE). W rzeczywistości z powodzeniem wykorzystaliśmy te procedury do uzyskania profili ekspresji RNA całej siatkówki¹ oraz RPE³. Użyteczność tych profili została silnie potwierdzona przez naszą niedawną identyfikację szlaków i rodzin genów, k...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bezprzewodowy silnik do tłuczka	VWR international	47747-370
Zasilacz prądu stałego	Lascar	PSU130	Każde zasilanie prądem stałym będzie odpowiednie. W przypadku innego urządzenia konkretne napięcie będzie wymagało dodatkowej optymalizacji.
Jednorazowy tłuczek &probówka typu microtube, 1,5 ml (wolna od DNazy, RNazy i pirogenów)	VWR international	47747-366	Służą one do pobierania tkanek do odczynnika TRIzol w celu analizy ekspresji.
Pinceta Dumont #5, końcówki: 0,05 x 0,01 mm, Inox	World Precision Instruments, Inc.	500341	Pożądany jest niewielki wymiar końcówki, jednak nie jest on bezwzględny, ponieważ może zajść potrzeba okresowego ostrzenia końcówki.
pinceta Dumont #5SF, końcówki: 0,025 x 0,005 mm, Inox	Fine Science Tools	11252-00	Pożądany jest niewielki wymiar końcówki, jednak nie jest on sztywno określony, ponieważ może zajść potrzeba okresowego ostrzenia końcówki.
płytki hodowlane polistyrenowe Falcon, 60 x 15 mm	BD Biosciences	351007	Płytki te są wykorzystywane jako płytki do sekcji.
Stereomikroskop Olympus SZX16	Olympus Corporation	SZX16	Można zastosować dowolny stereomikroskop. W poprzednich badaniach wykorzystaliśmy stereomikroskop marki Leica.1-3 bez żadnych problemów. Do samej dyssekcji używamy wyłącznie obiektywu 1X, mimo że zainstalowany jest również obiektyw 2X.
Kamień ostrzący	Fine Science Tools	29008-01	W razie potrzeby należy użyć tego narzędzia do zaostrzenia końcówki pęsety.
Płyta grzewcza	Tokai Hit	MATS-U55SZX2B	Służy to do utrzymania temperatury tkanki podczas całej dyssekcji oraz do zminimalizowania wpływu wahań temperatury na ekspresję genów. Cały mikroskop umieściliśmy również w pomieszczeniu o kontrolowanych warunkach środowiskowych w temperaturze 28°C.°C podczas sekcji w poprzednich badaniach1-3 z pomyślnym rezultatem.
Trizol, 100 mL	Invitrogen	15596-026
drut wolframowy, średnica 0,015 cala	World Precision Instruments, Inc.	TGW1510
Aplikator drewniany	Purytanin	807	Służy do mocowania chemicznie trawionej igły wolframowej.