Artykuł metodologiczny

Mikrodysekcja tkanek embrionalnego oka rybki zebrafish

16.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2028

⸱

27 czerwca 2010

 , 
1Department of Biological Sciences, Purdue University

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy artykuł opisuje metodę mikrodyssekcji siatkówek zebrafish (danio pręgowanego) z dołączonym lub usuniętym nabłonkiem barwnikowym siatkówki, z embrionów od jednego do trzech dni po zapłodnieniu.

Streszczenie

Danio pręgowany jest popularnym modelem zwierzęcym w badaniach nad rozwojem oka ze względu na jego szybkiex uterorozwój oraz wysoka płodność. Do 3 dni po zapłodnieniu (dpf) larwy wykazują pierwszą reakcję wzrokową. Zidentyfikowano wiele genów kontrolujących prawidłowy rozwój oka, jednak wciąż jesteśmy daleko od pełnego zrozumienia leżącej u podstaw architektury genetycznej. Profilowanie ekspresji genów w całym genomie jest użytecznym narzędziem do wyjaśnienia sieci regulacji genetycznej rozwoju oka. Jednak niewielki rozmiar zarodkowego oka u rybek zebrafish sprawia, że uzyskanie nienaruszonych i czystych tkanek oka do analizy ekspresji jest trudne. Na przykład długość przednio-tylna oka między 2. a 3. dniem wynosi zaledwie około 200-300 μm, podczas gdy średnica soczewki jest mniejsza niż 100 μm. Ponadto nabłonek barwnowy siatkówki (RPE) znajdujący się pod siatkówką jest tylko nabłonkiem jednowarstwowym. Chociaż profile ekspresji genów można uzyskać z całego zarodka, nie odzwierciedlają one dokładnie ekspresji w tych konkretnych tkankach. Dlatego w celu skutecznego profilowania ekspresji genów w rozwoju oka konieczne jest uzyskanie czystej tkanki. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy metodę mikrodysekcji nienaruszonej siatkówki oraz siatkówki z przytwierdzonym RPE w okresie od 1 do 3 dpf, co obejmuje główne etapy morfogenezy oka. Wszystkie procedury można przeprowadzić przy użyciu precyzyjnych pęset i ogólnego wyposażenia laboratoryjnego pod standardowymi stereomikroskopami. W przypadku dysekcji siatkówki, jednowarstwowy RPE jest usuwany i odrywany poprzez ruch omiatający oraz dzięki preferencyjnej adhezji pozostałości RPE do powierzchni płytki hodowlanej służącej do dysekcji. W przypadku dysekcji siatkówki z przytwierdzonym RPE, adhezja RPE do płytki dysekcyjnej jest usuwana przed przystąpieniem do zabiegu, dzięki czemu RPE może zostać w całości zachowany wraz z siatkówką. Ostrożne uniesienie tej tkanki pozwala na efektywne oddzielenie domniemanej ciała naczyniowej i twardówki. Soczewkę w obu przypadkach można usunąć za pomocą chemicznie trawionej igły wolframowej. Podsumowując, nasza metoda pozwala na uzyskanie nienaruszonych tkanek oka i została z powodzeniem wykorzystana do badania specyficznych dla tkanki profili ekspresji siatkówki rybek zebrafish1, 2i nabłonek barwnowy siatkówki3Empty source HTML. No content to translate.

Protokół

Część 1: Przygotowania przed mikrosekcją

  1. Roztwory
    1. pożywka E34 (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 oraz 0.33 mM MgSO4).
    2. roztwór Ringera1, 5 (116 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH7.2), sterylizowany przez filtrację.
    3. 5N NaOH.
  2. Trawienie chemiczne igieł wolframowych
    1. Zabezpieczyć mały zlew zawierający 5N NaOH na szalce Petriego za pomocą plasteliny.
    2. Przymocować spinacz biurowy do boku zlewu w taki sposób, aby stykał się z roztworem NaOH.
    3. Podłączyć elektrodę ujemną zasilacza prądu stałego do spinacza, a elektrodę dodatnią do jednego końca krótkiego odcinka (~2cm) drutu wolframowego.
    4. Drugi koniec drutu wolframowego owinąć małą kulką plasteliny i zanurzyć ten koniec w roztworze NaOH.
    5. Zwiększyć napięcie do około 3V i zanurzać drut góra-dół w roztworze NaOH, aż zostanie osiągnięta odpowiednia szybkość trawienia. Igłę dobrej jakości można zazwyczaj wytrawić w ciągu 10 minut.
    6. Drut wolframowy wystawiony na działanie roztworu będzie stopniowo cieńszy. Gdy kulka plasteliny odpadnie, druga strona drutu, wciąż przymocowana do elektrody dodatniej, będzie miała kształt ostrej igły.
    7. Opłukać ostrą igłę roztworem Ringera lub pożywką E3, aby usunąć osady soli.
    8. Przymocować igłę do drewnianego aplikatora taśmą lub za pomocą uchwytu do igieł, aby ułatwić manipulację.
  3. Płytki hodowlane
    1. Polistyrenowe płytki hodowlane Falcon 60 x 15 mm są gotowe do użycia w mikrodysekcji siatkówki.
    2. W przypadku dysekcji siatkówki przylegającej do RPE, na 30 minut przed zabiegiem całkowicie rozgnieść dwa embriony na płytce hodowlanej zawierającej roztwór Ringera, aby zniwelować przyleganie powierzchni. Tuż przed dysekcją obficie przemyć płytkę świeżym roztworem Ringera.
  4. Zbiór i wyznaczanie stadium embrionów
    1. Dorosłe danio pręgowane są utrzymywane zgodnie z opisem4, 5.
    2. W noc poprzedzającą rozród rozdzielić pary ryb rodzicielskich w statycznych zbiornikach hodowlanych za pomocą przegrody.
    3. Usunąć przegrodę następnego ranka po zapaleniu światła w pomieszczeniu. Umożliwić parom krzyżowanie się w 10-minutowych odstępach co pół godziny. Rozdzielać ryby po każdym krzyżowaniu.
    4. Embriony zebrane z każdego krzyżowania utrzymywać oddzielnie w pożywce E3 w temperaturze 28°C.
    5. Wyznaczyć stadium embrionów w 10 do 12 godzin po zapłodnieniu (hpf) i ponownie określić stadium bezpośrednio przed dysekcją w konkretnych punktach czasowych, zgodnie z ustalonymi kryteriami1, 6.

Część 2: Disekcja – usunięcie mózgu i odsłonięcie oka1

  • Procedury opisane w tej sekcji są wspólne dla preparowania siatkówki (część 3A) oraz siatkówki z przytwierdzonym nabłonkiem barwnikowym (RPE) (część 3B).
  • Wszystkie precyzyjne prace preparacyjne wykonuje się za pomocą końcówki pęsety Dumont, wspomagając się drugą pęsetą Dumont w celu odpowiedniego ułożenia tkanki. W razie potrzeby do bardziej precyzyjnych manipulacji można użyć trawionej chemicznie igły wolframowej.
  • Wszystkie precyzyjne prace preparacyjne są wykonywane przy powiększeniu ~ 5-8x pod mikroskopem Olympus SZX16 wyposażonym w obiektyw 1X lub odpowiednik.
  • Zarodki należy utrzymywać w medium E3 w inkubatorze laboratoryjnym w temperaturze 28°C obok mikroskopu, aby zapewnić łatwy dostęp do nich podczas preparowania.
  • Stolik mikroskopu jest podgrzewany do 28°C za pomocą płyty grzewczej, aby zminimalizować wpływ wahań temperatury na ekspresję genów.
  1. Przenieś embrion na konkretnym etapie rozwoju do roztworu Ringera w płytce hodowlanej Falcon 60 x 15 mm przygotowanej zgodnie z opisem w części 1#3.
  2. Szybko odetnij głowę wraz z częścią przedniego tułowia od reszty ciała.
  3. Przytwierdź tylny koniec tej tkanki do płytki hodowlanej za pomocą pęsety pomocniczej.
  4. Otwórz głowę od strony grzbietowej, zaczynając od przedniej części czoła.
  5. Usuń mózg w taki sposób, aby strona przyśrodkowa oczu była odsłonięta i skierowana do góry w celu przeprowadzenia dalszych manipulacji.

Część 3A: Disekcja siatkówki1

  1. Przygotować zarodek zgodnie z opisem w części 2.
  2. Ostrożnie omiatać końcówką pęsety odsłonięty RPE po stronie przyśrodkowej gałki ocznej skierowanej ku górze, aż do pojawienia się małego otworu w siatkówce.
  3. Kontynuować omiatanie i odwarstwianie, aż strona przyśrodkowa siatkówki zostanie niemal całkowicie odsłonięta. Należy unikać drapania i przebijania odsłoniętej siatkówki.
  4. Aby usunąć boczny RPE z siatkówki, która jest teraz skierowana w dół, należy zbliżyć się do niej i omiatać pod kątem około 45° względem powierzchni płytki hodowlanej.
  5. Usunąć RPE, który jest stosunkowo mocno przytwierdzony do ora serrata, przytwierdzając oddzieloną część RPE do płytki hodowlanej w celu przeprowadzenia dyssekcji, a następnie delikatnie unieść siatkówkę.
  6. Przetaczać siatkówkę po dnie naczynia hodowlanego, aby oczyścić ją z pozostałości RPE.
    1. Zauważono, że ta konkretna polistyrenowa płytka hodowlana Falcon wykazuje preferencyjną adhezję RPE przez około 20 minut po zmiażdżeniu zarodka. Właściwość ta jest wykorzystywana do usuwania pozostałości RPE. Jednak komórki siatkówki również przylegają do powierzchni w mniejszym stopniu, co można dokładnie sprawdzić pod dużym powiększeniem. Należy zachować równowagę między całkowitością usunięcia RPE a integralnością siatkówki.
    2. Soczewka często przylega do płytki hodowlanej i oddziela się od siatkówki podczas procesu przetaczania. Okazyjnie konieczne jest oddzielenie soczewki za pomocą trawionej igły wolframowej, wykonując ruch obrotowy na powierzchni soczewki.
  7. Procedury te pozwalają na skuteczne usunięcie RPE z siatkówki bez naruszania integralności tkanki. Wskazuje na to dobra ogólna morfologia (Rysunek 1B i B') oraz histologia (Rysunek 1B"). W szczególności zachowanie macierzy zewnątrzkomórkowej pomiędzy warstwą fotoreceptorów a RPE jest wyjątkowo dobre (Rysunek 1B", strzałka; porównać z histologią całego zarodka (Rysunek 1A")).

Część 3B: Disekcja siatkówki z przytwierdzonym RPE3

  1. Przygotować embrion zgodnie z opisem w Części 2.
  2. Przytwierdzić głowę do płytki hodowlanej za pomocą pęsety pomocniczej. Delikatnie unieść oko od bocznej strony tylnej i obrócić je w kierunku strony przedniej.
    1. Domniemana tkanka naczyniówki i twardówki znajdująca się na zewnętrznej stronie warstwy RPE jest stosunkowo ściśle przylegająca do skóry i może zostać w większości oddzielona poprzez ostrożne obrócenie oka w stronę przednią.
  3. Usunąć soczewkę za pomocą igły wolframowej po odsłonięciu bocznej strony oka, gdy oko jest wciąż przytwierdzone do skóry.
  4. Procedury te pozwalają na skuteczne zachowanie całej warstwy RPE wraz z siatkówką. Domniemane naczyniówki i tkanka twardówki mogą zostać w dużej mierze usunięte (Rycina 1C, C' oraz C").

Część 4: Pobieranie próbek tkanek do analizy RNA

  1. Precyzyjnie wycięte próbki można zebrać w odczynniku TRIzol do probówki mikrowirówkowej wolnej od RNaz w celu dalszej charakterystyki RNA, zgodnie z wcześniejszym opisem1.

Reprezentatywne wyniki

Etapy rozwoju embrionalnego, analiza histologiczna, obraz mikroskopowy, badanie biologii rozwoju.
Rysunek 1. (A) Widok boczny i (A') grzbietowy głowy larwy danio pręgowanego w 52 hpf przed sekcją. (A") Odpowiadający przekrój histologiczny głowy larwy z (A) i (A'). (B) Widok boczny i (B') grzbietowy wypreparowanej siatkówki w 54 hpf. Powierzchnia siatkówki była nienaruszona zarówno w widoku bocznym, jak i grzbietowym. (B") Odpowiadający przekrój histologiczny wypreparowanej siatkówki z (B) i (B'). Struktura siatkówki oraz laminacja siatkówki były nienaruszone. W szczególności macierz zewnątrzkomórkowa między warstwą fotoreceptorów a RPE (A", strzałki) była dobrze zachowana w wypreparowanej siatkówce (B", strzałki). (C) Widok boczny i (C') przyśrodkowy wypreparowanej siatkówki z przytwierdzonym RPE w 52 hpf. Warstwa RPE była nienaruszona i ciągła, co potwierdził również przekrój histologiczny wypreparowanej tkanki (C"). Biały obszar w C' to nerw wzrokowy (strzałka). Do badań histologicznych pobrano próbki tkanek i utrwalono je w 4% paraformaldehydzie. Zatapianie w plastiku i krojenie tych próbek wykonano zgodnie z opisem3. Pasek skali = 50 μm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Mikrodysekcja tkanek oka danio pręgowanego pozwala na skuteczne pozyskanie nienaruszonych siatkówek oraz siatkówek z przytwierdzonym nabłonkiem barwnikowym siatkówki (RPE). Znacznie ułatwia to badania ekspresji dotyczące konkretnej tkanki oka (tj. siatkówki lub RPE). W rzeczywistości z powodzeniem wykorzystaliśmy te procedury do uzyskania profili ekspresji RNA całej siatkówki1 oraz RPE3. Użyteczność tych profili została silnie potwierdzona przez naszą niedawną identyfikację szlaków i rodzin genów, k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami określonymi przez Purdue Animal Care and Use Committee.

Podziękowania

Niniejsza praca jest wspierana z funduszy startowych Departamentu Nauk Biologicznych na Uniwersytecie Purdue.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bezprzewodowy silnik do tłuczkaVWR international47747-370
Zasilacz prądu stałegoLascarPSU130Każde zasilanie prądem stałym będzie odpowiednie. W przypadku innego urządzenia konkretne napięcie będzie wymagało dodatkowej optymalizacji.
Jednorazowy tłuczek &probówka typu microtube, 1,5 ml (wolna od DNazy, RNazy i pirogenów)VWR international47747-366Służą one do pobierania tkanek do odczynnika TRIzol w celu analizy ekspresji.
Pinceta Dumont #5, końcówki: 0,05 x 0,01 mm, InoxWorld Precision Instruments, Inc.500341Pożądany jest niewielki wymiar końcówki, jednak nie jest on bezwzględny, ponieważ może zajść potrzeba okresowego ostrzenia końcówki.
pinceta Dumont #5SF, końcówki: 0,025 x 0,005 mm, InoxFine Science Tools11252-00Pożądany jest niewielki wymiar końcówki, jednak nie jest on sztywno określony, ponieważ może zajść potrzeba okresowego ostrzenia końcówki.
płytki hodowlane polistyrenowe Falcon, 60 x 15 mmBD Biosciences351007Płytki te są wykorzystywane jako płytki do sekcji.
Stereomikroskop Olympus SZX16Olympus CorporationSZX16Można zastosować dowolny stereomikroskop. W poprzednich badaniach wykorzystaliśmy stereomikroskop marki Leica.1-3 bez żadnych problemów. Do samej dyssekcji używamy wyłącznie obiektywu 1X, mimo że zainstalowany jest również obiektyw 2X.
Kamień ostrzącyFine Science Tools29008-01W razie potrzeby należy użyć tego narzędzia do zaostrzenia końcówki pęsety.
Płyta grzewczaTokai HitMATS-U55SZX2BSłuży to do utrzymania temperatury tkanki podczas całej dyssekcji oraz do zminimalizowania wpływu wahań temperatury na ekspresję genów. Cały mikroskop umieściliśmy również w pomieszczeniu o kontrolowanych warunkach środowiskowych w temperaturze 28°C.°C podczas sekcji w poprzednich badaniach1-3 z pomyślnym rezultatem.
Trizol, 100 mLInvitrogen15596-026
drut wolframowy, średnica 0,015 calaWorld Precision Instruments, Inc.TGW1510
Aplikator drewnianyPurytanin807Służy do mocowania chemicznie trawionej igły wolframowej.

Bibliografia

  1. Leung, Y. F., Dowling, J. E. Gene expression profiling of zebrafish embryonic retina. Zebrafish. 2, 269-283 (2005).
  2. Leung, Y. F., Ma, P., Link, B. A., Dowling, J. E. Factorial microarray analysis of zebrafish retinal development. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 12909-12914 (2008).
  3. Leung, Y. F., Ma, P., Dowling, J. E. Gene expression profiling of zebrafish embryonic retinal pigment epithelium in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 881-890 (2007).
  4. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish : a practical approach. , 1st ed, Oxford University Press. Oxford ; New York. (2002).
  5. Westerfield, M. The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).
  6. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  7. Fadool, J. M., Dowling, J. E. Zebrafish: a model system for the study of eye genetics. Prog Retin Eye Res. 27, 89-110 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oddzielenie siatk wkisiatk wka z przytwierdzeniem nab onka pigmentowegotechnika mikrodysekcjichemicznie trawiona ig a wolframowap ytka hodowlana Falconstereomikroskopizolacja tkankianaliza ekspresji RNAprzygotowanie zarodka

Powiązane artykuły