Fluorescencyjnie znakowana izolacja komórek T-ALL: metoda izolacji komórek T-ALL od dorosłych danio pręgowanego

Streszczenie

Źródło: Pruitt, M. M., et al. Izolacja populacji bocznej w indukowanej przez Myc ostrej białaczce limfoblastycznej z komórek T u danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2017).

Ten protokół opisuje technikę izolowania fluorescencyjnie znakowanych komórek nowotworowych ostrej białaczki limfoblastycznej (T-ALL) komórek nowotworowych z dorosłego danio pręgowanego i ilościowego oznaczania ich za pomocą niebieskiego barwnika trypanowego.

Protokół

1. Zbiór fluorescencyjnie znakowanych komórek T-ALL od pierwotnej ryby nowotworowej

1. Przygotuj co najmniej 20 ml 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej w 0,9x buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (FBS/PBS).
2. Dodać 1 ml FBS/PBS do jednej fiolki soli sodowej heparyny (300 jednostek).
3. Wybierz ryby z guzami w ponad 50% ciała lub te ryby, które mają trudności z jedzeniem lub pływaniem. Poświęć rybę, przedawkowując ją tricainą lub zanurzając w lodowatej wodzie. Potwierdzić śmierć przez brak ruchu skrzeli i bicia serca.
4. Użyj żyletki, aby usunąć głowę ryby.
5. Przemyć jamę ryby roztworem heparyny w celu usunięcia nadmiaru czerwonych krwinek.
   1. Za pomocą pipety wstrzyknąć 100 μl roztworu heparyny (dodać 1 ml FBS/PBS do jednej fiolki z solą sodową heparyny) do jamy ciała ryby. Usuń cały płyn, który się wyleje (będzie zawierał krwinki) i odpipetuj go do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
   2. Użyj świeżej końcówki pipety, aby ponownie umyć ciało. Wykonaj co najmniej trzy prania lub do momentu, gdy wylewający się płyn będzie wyglądał na wolny od krwi.
   3. Na tych etapach należy wylać cały płyn z myjek, ponieważ nie będzie on używany w dalszych analizach.
6. Zbierz komórki białaczkowe.
   1. Wstrzyknąć 100 μl FBS/PBS do jamy ciała ryby.
   2. Delikatnie uciskaj zewnętrzną część ciała ryby końcówką pipety, aby wycisnąć/wypchnąć komórki nowotworowe.
      nuta: Jeśli ten krok zostanie wykonany przy użyciu mikroskopu preparacyjnego, komórki nowotworowe wylewające się z jamy ciała będą widoczne.
   3. Zbierz płyn i komórki z każdego płukania do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
   4. Powtarzaj kroki 1.6.1-1.6.3, aż większość komórek nowotworowych zostanie zebrana (zwykle 5-10 razy). Zbierz wszystkie komórki nowotworowe do tej samej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Utrzymuj komórki w temperaturze pokojowej.
7. Wymieszaj zebrane komórki nowotworowe z poprzedniego kroku, delikatnie pipetując je, aby dysocjować grudki komórek. Przefiltruj zawiesinę komórek przez filtr siatkowy o wielkości 40 μm. Umyj filtr 1-2 razy 100 μl FBS/PBS. Utrzymuj komórki w temperaturze pokojowej.
8. Wymieszaj 2 μl zawiesiny komórek z 18 μl błękitu trypanowego (0,4%, rozcieńczonego w stosunku 1:10 i przefiltrowanego) w nowej probówce. Załaduj 10 μl na hemocytometr i policz liczbę żywych (nieniebieskich) komórek fluorescencyjnych, aby obliczyć liczbę izolowanych komórek nowotworowych.
   nuta: Nieniebieskie komórki GFP-ujemne są prawdopodobnie normalnymi, niezłośliwymi komórkami T i nie powinny być liczone. Do barwienia komórek za pomocą Hoechst 33342 wymagane są co najmniej 2 x 10⁶ komórek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Syngeniczny danio pręgowany (CG2)			Patrz Mizgireuv et al., 2006
RAG2: Plazmid C-Myc			Laboratorium Langenau
rag2: Plazmid GFP skonstruowany w laboratorium de Jong			promotor rag2 z Laboratorium Langenau
Plazmid transpozazy pCS2			Laboratorium Chien
Mikroskop SteREO Discovery V8	Mikroskopia Carla Zeissa	Numer telefonu 495015-0008-000
Metanosulfonian trikainy (MS-222)	Western Chemical, Inc	Fisher Scientific - NC0342409	Opakowanie 100 gramów
Surowica płodowa bydlęca (FBS)	HyClone Laboratories, Inc.	Fisher Scientific - SH3007103	500 ml
sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Gibco firmy Life Technologies	Numer katalogowy 1001-023	pH 7,4 (1x) - 500 ml
Sól sodowa heparyny	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy 2106	15 - 300 fiolek jednostkowych
Filtr siatkowy 40 μm	Marka Falcon Corning	Numer telefonu 352340	Przypadek 50
Trypan niebieski	Sigma Nauki przyrodnicze	Zobacz materiał T8154	20 ml - Roztwór (0,4%)