$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Barwienie fluorescencyjnie znakowanych komórek T-ALL za pomocą Hoechst 33342 w celu identyfikacji populacji bocznej
- Rozcieńczyć Hoechst 33342 1:10 wolnym od nukleazH2O, aby uzyskać stężenie robocze 1 mg/ml. Barwnik należy przechowywać w temperaturze 4 °C i w ciemności.
- Przygotować 100 mM roztwór werapamilu, rozpuszczając 49,1 mg w 1 ml dimetylosulfotlenku (DMSO).
nuta: Werapamil jest inhibitorem transporterów ABC i stanowi ważną kontrolę w eksperymentach populacyjnych ubocznych. Dodanie werapamilu do próbek zahamuje zdolność transporterów ABC do wypływu barwnika Hoechst 33342. W związku z tym prawdziwa populacja poboczna zniknie po dodaniu werapamilu do próbki.
- Ustawić łaźnię wodną na 28 °C.
- Przygotuj próbki i kontrole w ciemności, dodając komórki i roztwory do probówek do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS).
- Przygotuj próbki, dodając 106 komórek, 15 μl 1 mg/ml Hoechst 33342 i 2,5 μl DMSO do probówki FACS. Dostosuj objętość do 1 ml za pomocą FBS/PBS.
- Przygotować kontrole, dodając 106 komórek, 15 μl 1 mg/ml Hoechst 33342 i 2,5 μl 100 mM werapamilu do probówki FACS. Dostosuj objętość do 1 ml za pomocą FBS/PBS.
nuta: Zalecane jest co najmniej 106 komórek na próbkę, ale preferowane jest barwienie większej liczby komórek, zwłaszcza jeśli komórki populacji bocznej zostaną posortowane do dalszej analizy. Nie przekraczać 106 komórek/ml i utrzymywać stężenie Hoechst 33342 na poziomie 15 μg/ml. Jeśli 10 x 106 komórek jest wybarwionych, całkowita objętość reakcji wynosi 10 ml.
- Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 28 °C w ciemności przez 120 min.
- Po inkubacji umieść komórki natychmiast na lodzie i trzymaj je w ciemności.
- Granulować komórki w temperaturze 4 °C przez 6 minut przy 300 x g. Usunąć supernatant. Umyć 1 ml FBS/PBS.
- Granulować komórki w temperaturze 4 °C przez 6 minut przy 300 x g. Usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml FBS/PBS.
- Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu sortowania komórek.
- 15 minut przed sortowaniem komórek dodać 2 μl jodku propidyny (PI) (1 mg/ml) do każdego 1 ml FBS/PBS (końcowe stężenie: 2 μg/ml). Dobrze wymieszaj.
2. Użyj FACS, aby znaleźć populację boczną w fluorescencyjnie znakowanej populacji komórek T-ALL
- Analizuj barwione zawiesiny komórek T-ALL danio pręgowanego na sortowniku komórek wyposażonym w laser UV do wzbudzania barwnikiem Hoechst 33342 i laser 488 nm do wzbudzania PI i wykrywania komórek T-ALL GFP+.