Szczepienie wysp trzustkowych: metoda wszczepiania wysp trzustkowych do przedniej komory oka myszy w celu obrazowania in vivo

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz komisję rewizyjną weterynaryjną Jove

1. Przygotowanie sprzętu do transplantacji i stołu chirurgicznego

UWAGA: Wszystkie narzędzia chirurgiczne powinny być sterylizowane w autoklawie, a stół operacyjny i narzędzia dezynfekowane 70% alkoholem.

1. Podłącz stereotaktyczny uchwyt głowy do znieczulenia za pomocą maski na nos i włącz poduszkę grzewczą.
2. Podłącz gazoszczelną strzykawkę Hamilton do rurki polietylenowej i kaniuli z oczkiem.
   nuta: Zaleca się wypełnienie wszystkich części PBS przed montażem. Sprawdź, czy nie ma uwięzionych pęcherzyków powietrza i usuń, jeśli są obecne.
3. Przymocuj strzykawkę Hamiltona mocno do stołu (Rysunek 1a) lub ruchomej podstawy (Rysunek 1e) i przymocuj rurkę do mikroskopu stereoskopowego, z kaniulą zwisającą w dół (tj. w pozycji oczekującej).
   nuta: Użyj taśmy chirurgicznej, ponieważ można ją łatwo zdjąć i ponownie przymocować.
4. Przygotować strzykawkę o pojemności 1 ml połączoną z igłą 30 g wypełnioną roztworem buprenorfiny o stężeniu 0,1 mg/kg.
5. Przygotować strzykawkę ze sterylnym PBS. Alternatywnie użyj pipety.
6. Odłóż na bok czystą klatkę budzenia z lampą grzewczą.

2. Znieczulenie i umiejscowienie myszy biorców do operacji

UWAGA: Wszystkie zwierzęta były hodowane i utrzymywane w środowisku wolnym od patogenów w obiektach dla zwierząt na Uniwersytecie w Lund.

1. Znieczulij mysz w komorze wypełnionej 40% O₂/60% N₂/3% izofluranem i przenieś znieczuloną mysz na platformę uchwytu głowy na ciepłej poduszce grzewczej (rysunek 1a). Sprawdź, czy nie ma odruchów pedałowania.
   nuta: Znieczulenie izofluranem jest preferowaną metodą znieczulenia w celu szybkiego powrotu do zdrowia po operacji. Pomieszczenie mikroskopu musi być odpowiednio wentylowane, aby można było stosować izofluran.
2. Umieść pysk myszy w masce anestezjologicznej podłączonej do aparatu do znieczulenia izofluranem 40% O₂ /60% N₂ 0,9%–1,5%. Użyj kciuka i palca, aby lekko podnieść głowę do góry i zapnij ją za pomocą metalowych elementów po bokach. Upewnij się, że słuchawki mocują głowę bezpośrednio pod uszami. Wstrzyknąć 0,1 mg/kg roztworu buprenorfiny podskórnie w grzbiet myszy.
   nuta: Buprenorfina jest stosowana jako środek przeciwbólowy.
3. Przechyl głowę tak, aby oko, które ma być operowane, było skierowane do góry i znajdowało się blisko badacza.
4. Delikatnie cofnij powieki oka, które ma zostać przeszczepione, za pomocą kleszczy, wysuń oko i luźno przymocuj pęsetą. Upewnij się, że końcówki pęsety są pokryte rurką polietylenową przymocowaną do platformy uchwytu głowicy (Rysunek 1a, wstawka).
5. Zawsze utrzymuj oba oczy mokre, nakładając kroplę sterylnego PBS na oko.
6. Przenieść ludzkie wyspy trzustkowe z zamkniętej probówki o pojemności 1,5 ml (sekcja 1) na szalkę Petriego ze sterylnym PBS i upewnić się, że wysepki znajdują się blisko siebie, aby zminimalizować ilość przenoszonej pożywki do hodowli komórkowych (ryc. 1c).
7. Zbierz ~20–30 wysepek w kaniuli oka połączonej rurką polietylenową ze strzykawką Hamiltona.
   nuta: Weź jak najmniej płynu z wysepkami.
8. Zawieś rurkę do góry nogami i przymocuj do mikroskopu stereoskopowego (Rysunek 1d). Ostrożnie przyklej rurkę, aby wysepki opadły na koniec rurki w kierunku kaniuli.

3. Procedura transplantacji

UWAGA: Ta metoda została wcześniej opisana do przeszczepiania mysich wysp trzustkowych. Nieco zmodyfikowana procedura jest przedstawiona tutaj.

1. Ściśnij opuszki na tylnych nogach, aby upewnić się, że mysz śpi.
2. Zaciśnij kleszcze krępujące oko, nie zakłócając przepływu krwi i nałóż kroplę sterylnego PBS na oko.
3. Używając igły 25 G jako skalpela, skosować do góry, ostrożnie wbić tylko połowę końcówki w rogówce i wykonać pojedyncze boczne nacięcie. Zrób otwór pod kątem do góry; otwór łatwiej się uszczelni po przeszczepie (ryc. 1f).
4. Ostrożnie podnieś rogówkę z kaniulą wstępnie załadowaną wyspami trzustkowymi i powoli przyłóż wysepki do oka. Unikaj wkładania kaniuli do przedniej komory, aby zapobiec uszkodzeniu tęczówki, ale raczej ostrożnie dociśnij do otworu rogówki (ryc. 1g). Powoli wycofaj kaniulę z ACE.
   nuta: Należy dążyć do uzyskania objętości wstrzyknięcia wynoszącej 3–8 μl. Jeśli objętość jest zbyt duża, narazi oko na niepotrzebnie wysokie ciśnienie wewnątrzgałkowe i może spowodować refluks ostrzykniętych wysp trzustkowych z komory przedniej.
5. W przypadku trudności z wstawieniem wysepek z powodu zwiększonego ciśnienia w komorze oka, należy powiększyć miejsce nacięcia, wzmacniając boczne miejsce nacięcia i ponownie założyć wyspy trzustkowe.
   nuta: Czasami wprowadzone pęcherzyki powietrza mogą być używane jako uchwyty przestrzeni.
6. Nałóż żel pod oczy na oko, poluzuj kleszczyki krępujące oczy i pozostaw mysz na izofluranie w tej samej pozycji na 8-10 minut, aby wyspy trzustkowe się zastygły.
7. Zdejmij kleszcze przytrzymujące powiekę i ustaw powiekę z powrotem w normalnej pozycji.
8. Wyjmij mysz z uchwytu na głowę i przenieś ją do klatki budzenia.
9. Gdy mysz jest obudzona i porusza się, przenieś ją z powrotem do oryginalnej klatki i trzymaj w pomieszczeniu dla zwierząt do czasu skanowania (zalecane jest co najmniej 5 dni).

Rycina 1: Przeszczepienie wysp trzustkowych do przedniej komory oka.
(a) Zestaw do przeszczepu przedstawiający znieczuloną mysz umieszczoną w stereotaktycznym uchwycie głowy i odsłonięte oko (wstawkę) obok przygotowanej strzykawki Hamiltona przymocowanej do stołu i mikroskopu stereoskopowego gotowego do pobrania mysich wysepek trzustkowych (b) lub ludzkich (c). (d) Pozycja oczekiwania kaniuli oka obciążonej wysepkami. (e) Przeszczep w trakcie realizacji, oraz (f) schematyczny rysunek pojedynczego nacięcia bocznego służącego do ostrożnego podniesienia rogówki za pomocą końcówki kaniuli oka i dozowania wysp trzustkowych do komory przedniej (g). Obraz oka bezpośrednio po wstrzyknięciu wysepek mysich (h) lub ludzkich wysepek (i). Podziałka = 500 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.