Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz komisję rewizyjną weterynaryjną Jove
1. Przygotowanie sprzętu do transplantacji i stołu chirurgicznego
UWAGA: Wszystkie narzędzia chirurgiczne powinny być sterylizowane w autoklawie, a stół operacyjny i narzędzia dezynfekowane 70% alkoholem.
- Podłącz stereotaktyczny uchwyt głowy do znieczulenia za pomocą maski na nos i włącz poduszkę grzewczą.
- Podłącz gazoszczelną strzykawkę Hamilton do rurki polietylenowej i kaniuli z oczkiem.
nuta: Zaleca się wypełnienie wszystkich części PBS przed montażem. Sprawdź, czy nie ma uwięzionych pęcherzyków powietrza i usuń, jeśli są obecne.
- Przymocuj strzykawkę Hamiltona mocno do stołu (Rysunek 1a) lub ruchomej podstawy (Rysunek 1e) i przymocuj rurkę do mikroskopu stereoskopowego, z kaniulą zwisającą w dół (tj. w pozycji oczekującej).
nuta: Użyj taśmy chirurgicznej, ponieważ można ją łatwo zdjąć i ponownie przymocować.
- Przygotować strzykawkę o pojemności 1 ml połączoną z igłą 30 g wypełnioną roztworem buprenorfiny o stężeniu 0,1 mg/kg.
- Przygotować strzykawkę ze sterylnym PBS. Alternatywnie użyj pipety.
- Odłóż na bok czystą klatkę budzenia z lampą grzewczą.
2. Znieczulenie i umiejscowienie myszy biorców do operacji
UWAGA: Wszystkie zwierzęta były hodowane i utrzymywane w środowisku wolnym od patogenów w obiektach dla zwierząt na Uniwersytecie w Lund.
- Znieczulij mysz w komorze wypełnionej 40% O2/60% N2/3% izofluranem i przenieś znieczuloną mysz na platformę uchwytu głowy na ciepłej poduszce grzewczej (rysunek 1a). Sprawdź, czy nie ma odruchów pedałowania.
nuta: Znieczulenie izofluranem jest preferowaną metodą znieczulenia w celu szybkiego powrotu do zdrowia po operacji. Pomieszczenie mikroskopu musi być odpowiednio wentylowane, aby można było stosować izofluran.
- Umieść pysk myszy w masce anestezjologicznej podłączonej do aparatu do znieczulenia izofluranem 40% O2 /60% N2 0,9%–1,5%. Użyj kciuka i palca, aby lekko podnieść głowę do góry i zapnij ją za pomocą metalowych elementów po bokach. Upewnij się, że słuchawki mocują głowę bezpośrednio pod uszami. Wstrzyknąć 0,1 mg/kg roztworu buprenorfiny podskórnie w grzbiet myszy.
nuta: Buprenorfina jest stosowana jako środek przeciwbólowy.
- Przechyl głowę tak, aby oko, które ma być operowane, było skierowane do góry i znajdowało się blisko badacza.
- Delikatnie cofnij powieki oka, które ma zostać przeszczepione, za pomocą kleszczy, wysuń oko i luźno przymocuj pęsetą. Upewnij się, że końcówki pęsety są pokryte rurką polietylenową przymocowaną do platformy uchwytu głowicy (Rysunek 1a, wstawka).
- Zawsze utrzymuj oba oczy mokre, nakładając kroplę sterylnego PBS na oko.
- Przenieść ludzkie wyspy trzustkowe z zamkniętej probówki o pojemności 1,5 ml (sekcja 1) na szalkę Petriego ze sterylnym PBS i upewnić się, że wysepki znajdują się blisko siebie, aby zminimalizować ilość przenoszonej pożywki do hodowli komórkowych (ryc. 1c).
- Zbierz ~20–30 wysepek w kaniuli oka połączonej rurką polietylenową ze strzykawką Hamiltona.
nuta: Weź jak najmniej płynu z wysepkami.
- Zawieś rurkę do góry nogami i przymocuj do mikroskopu stereoskopowego (Rysunek 1d). Ostrożnie przyklej rurkę, aby wysepki opadły na koniec rurki w kierunku kaniuli.
3. Procedura transplantacji
UWAGA: Ta metoda została wcześniej opisana do przeszczepiania mysich wysp trzustkowych. Nieco zmodyfikowana procedura jest przedstawiona tutaj.
- Ściśnij opuszki na tylnych nogach, aby upewnić się, że mysz śpi.
- Zaciśnij kleszcze krępujące oko, nie zakłócając przepływu krwi i nałóż kroplę sterylnego PBS na oko.
- Używając igły 25 G jako skalpela, skosować do góry, ostrożnie wbić tylko połowę końcówki w rogówce i wykonać pojedyncze boczne nacięcie. Zrób otwór pod kątem do góry; otwór łatwiej się uszczelni po przeszczepie (ryc. 1f).
- Ostrożnie podnieś rogówkę z kaniulą wstępnie załadowaną wyspami trzustkowymi i powoli przyłóż wysepki do oka. Unikaj wkładania kaniuli do przedniej komory, aby zapobiec uszkodzeniu tęczówki, ale raczej ostrożnie dociśnij do otworu rogówki (ryc. 1g). Powoli wycofaj kaniulę z ACE.
nuta: Należy dążyć do uzyskania objętości wstrzyknięcia wynoszącej 3–8 μl. Jeśli objętość jest zbyt duża, narazi oko na niepotrzebnie wysokie ciśnienie wewnątrzgałkowe i może spowodować refluks ostrzykniętych wysp trzustkowych z komory przedniej.
- W przypadku trudności z wstawieniem wysepek z powodu zwiększonego ciśnienia w komorze oka, należy powiększyć miejsce nacięcia, wzmacniając boczne miejsce nacięcia i ponownie założyć wyspy trzustkowe.
nuta: Czasami wprowadzone pęcherzyki powietrza mogą być używane jako uchwyty przestrzeni.
- Nałóż żel pod oczy na oko, poluzuj kleszczyki krępujące oczy i pozostaw mysz na izofluranie w tej samej pozycji na 8-10 minut, aby wyspy trzustkowe się zastygły.
- Zdejmij kleszcze przytrzymujące powiekę i ustaw powiekę z powrotem w normalnej pozycji.
- Wyjmij mysz z uchwytu na głowę i przenieś ją do klatki budzenia.
- Gdy mysz jest obudzona i porusza się, przenieś ją z powrotem do oryginalnej klatki i trzymaj w pomieszczeniu dla zwierząt do czasu skanowania (zalecane jest co najmniej 5 dni).
