Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie do przeszczepu guza
- Pomieszczenia dla zwierząt
- Zdobądź generyczne myszy C57BL/6 od komercyjnego dostawcy hodowlanego.
- Myszy domowe (5) w indywidualnych wentylowanych klatkach w następujących warunkach: Temperatura: 20–26 °C; wilgotność 30–70%; cykl oświetlenia: 12 godzin światła i 12 godzin ciemności.
- Używaj ściółki z kolb kukurydzy, która jest zmieniana co tydzień.
- W przypadku diety należy zapewnić sterylizowany promieniowaniem suchy granulat żywności przez cały okres badania.
- Jeśli chodzi o wodę, zapewnij zwierzętom swobodny dostęp do sterylnej wody pitnej.
- Przygotowanie fragmentu guza dawcy
- Zacznij od monitorowania masy ciała (BW), poprzez ważenie za pomocą wagi, oraz objętości guza (TV), poprzez pomiar suwmiarkowy, myszy dawców z nowotworem.
- Gdy telewizja osiągnie 500–1200 mm3, poddaj zwierzę eutanazji w kapturze chroniącym przed zagrożeniem biologicznym zgodnie z protokołem.
- Wysterylizuj skórę wokół guza za pomocą wacików jodoforowych.
- Chirurgicznie usunąć guz zgodnie z protokołem.
- Sprawdź wzrokowo i palpacyjnie pod kątem obecności wyczuwalnych palpacyjnie guzów przed zakończeniem.
- Aby zakończyć terminację, najpierw poddaj myszy eutanazji zgodnie z zatwierdzonym protokołem, otwórz brzuch i wizualnie zbadaj trzustkę pod kątem guzów.
- Odetnij guz za pomocą operacji po śmierci i dodaj go do zimnego PBS. Umieść wszystkie zwierzęta w czystej, nienaładowanej, półprzezroczystej komorze eutanazyjnej ze specjalną pokrywą z portem do dostarczania dwutlenku węgla, który ma być użyty.
- Odprowadzać gaz do komory z natężeniem przepływu, które powoduje szybką utratę przytomności przy minimalnym stresie zwierzęcia. Optymalne natężenie przepływu dla CO2 powinno wynosić około 2–2,5 l/min.
- Obserwuj wzrokowo każde zwierzę podczas procedury eutanazji, aby upewnić się, że wszystkie zwierzęta otrzymują odpowiednie stężenie gazu i nie odzyskują przytomności podczas procedury eutanazji.
- Utrzymuj przepływ gazu przez co najmniej 1 minutę po pozornej śmierci klinicznej, aby zminimalizować możliwość wyzdrowienia zwierzęcia (jeśli ma bezdech, ale nie jest martwe).
- Usuń sąsiednie tkanki nienowotworowe. Oczyszczony guz można szybko sfotografować.
Umieść tkanki nowotworowe w RPMI-1640 i trzymaj na lodzie przed dysocjacją.
nuta: Tusze zwierzęce są pakowane w worki i przechowywane w odpowiedniej zamrażarce w oczekiwaniu na wyjęcie.
- Umieścić guz na szalce Petriego zawierającej 20 ml PBS (przed eutanazją zwierząt należy wstępnie schłodzić pożywkę lub bufor do temperatury 4 °C).
- Jeśli krew jest zanieczyszczająca, przenieś guz na inną szalkę Petriego i umyj guz PBS.
- Przeciąć guz na pół, usuwając dodatkową skórę, naczynia, zwapnienia i/lub martwicę.
- Wybierz tylko nienaruszone fragmenty guza i umieść je w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i dodaj 20 ml PBS, a następnie przetransportuj probówkę do oddzielnego pomieszczenia dla zwierząt w celu badań farmakologicznych.
2. Ortotopowa implantacja trzustki
- Znieczulenie i analgezja
- Użyj 2 ml ketaminy do wstrzykiwań i 0,42 ml ksylazyny do wstrzykiwań (20 mg/ml) zmieszanych z 5,91 sterylną wodą do wstrzykiwań lub solą fizjologiczną w objętości dawki 0,06–0,1 ml/20-25 g masy ciała.
UWAGA: Zgodnie z dobrostanem zwierząt analgezja jest konieczna zarówno przed, jak i po operacji. 0,05–0,1 mg buprenorfiny/kg, SC. Pierwsza dawka jest podawana przed operacją, a następnie dozowana 3 razy co 4 godziny po operacji w sposób ciągły.
- Operacja chirurgiczna w celu implantacji ortotopowej
- Znieczulenie myszy poprzez wstrzyknięcie domięśniowe (IM). Znieczulić zwierzę biorcy 5% izofluranem, który jest utrzymywany przez stożek nosowy w poziomie 1%. Zwierzę zacznie się relaksować, tracąc odruch prostowania i ostatecznie stanie się nieruchome. Na tej głębokości znieczulenia mogą być łatwo obudzone przez bolesne bodźce; Pozwól, aby znieczulenie się pogłębiło, aż takie reakcje na ból znikną.
- Po całkowitym znieczuleniu zwierząt zamocuj myszy na tablicy doświadczalnej w odpowiedniej pozycji bocznej.
- Utrzymuj myszy we właściwej pozycji bocznej. Zdezynfekuj skórę wokół śledziony jodem, a następnie odjoduj 75% alkoholem etylowym.
- Znajdź środkowy punkt śledziony i wykonaj 1 cm pionowe nacięcie na brzuchu, aby odsłonić śledzionę.
- Delikatnie wyciągnij część tkanki trzustki pod śledzioną za pomocą pęsety z płaską końcówką i zszyj fragment guza homoprzeszczepu myszy z myszy nasiennej na trzustce myszy biorcy za pomocą wchłanialnego szwu chirurgicznego 9-0.
- Zamknij brzuch jedwabnym szwem 6-0 podwójnym szwem. Osiągnij homeostazę przez kompresję.
- Po zakończeniu implantacji guza, jeśli nie wystąpi krwawienie ani wyciek tkanki nowotworowej, należy trzymać zwierzęta w ciepłej klatce.
- Monitorować zwierzę do momentu, gdy odzyska przytomność wystarczającą do utrzymania pozycji leżącej mostka; po całkowitym wyzdrowieniu ze znieczulenia należy je umieścić w pomieszczeniu dla zwierząt. Monitoruj myszy z guzem, badając palpacyjnie brzuch w pobliżu śledziony i wybierz myszy z guzami ortotopowymi.
3. Monitorowanie zdrowia myszy z nowotworami
- Codziennie sprawdzaj spożycie wody i żywności.
- Zbadaj wygląd myszy pod kątem niezadbanej sierści, grudek, cienkiej skóry, nieprawidłowego oddechu lub wodobrzusza.
- Zbadaj palpacyjnie brzuch, aby sprawdzić, czy nie ma spontanicznych guzów na wątrobie lub śledzionie.
- Waż myszy co tydzień za pomocą wagi.
- Jeśli zaobserwuje się którykolwiek z następujących objawów klinicznych, myszy są poświęcane w celu pobrania próbki i przeprowadzenia sekcji zwłok: utrata masy ciała >20%; upośledzenie ruchomości (niezdolność do jedzenia lub picia); niezdolność do normalnego poruszania się z powodu znacznego wodobrzusza i powiększonego brzucha; wysiłek w oddychaniu.
