Modele eksperymentalne do badania fizjologii i patofizjologii nabłonka pigmentowego siatkówki

Podsumowanie

Przedstawiamy powtarzalną metodę hodowli konfluentnych monowarstw ludzkich płodowych komórek nabłonka pigmentowego siatkówki (hfRPE), które wykazują morfologię, fizjologię, polarność oraz wzorce ekspresji białek i genów charakterystyczne dla natywnej tkanki dorosłego organizmu. Praca ta została rozszerzona o model zwierzęcy kilku chorób oczu.

Streszczenie

Opracowaliśmy procedurę hodowli komórkowej, która pozwala na otrzymanie dużych ilości konfluencyjnych monowarstw pierwotnych hodowli ludzkiego płodowego nabłonka pigmentowego siatkówki (hfRPE) o charakterystyce morfologicznej, fizjologicznej i genetycznej odpowiadającej natywnemu ludzkiemu RPE. Hodowle komórek hfRPE wykazują silną pigmentację, a mikroskopia elektronowa ujawnia liczne mikrokosmki błony apikalnej. Kompleksy połączeń zidentyfikowano za pomocą znakowania immunofluorescencyjnego różnych białek połączeń ścisłych. Polarność nabłonkowa i funkcje tych łatwo reprodukowalnych hodowli pierwotnych ściśle przypominają wcześniej badane modele ssacze natywnego RPE, w tym ludzki. Wyniki te zostały rozszerzone o opracowanie interwencji terapeutycznych w kilku modelach zwierzęcych ludzkich chorób oka. Skupiliśmy się na strategiach usuwania nieprawidłowych gromadzeń płynu w siatkówce lub przestrzeni podsiatkówkowej. Zewnątrzkomórkowa przestrzeń podsiatkówkowa oddziela zewnętrzne segmenty fotoreceptorów od błony apikalnej RPE i ma kluczowe znaczenie dla utrzymania przylegania siatkówki oraz szeregu oddziaływań między RPE a siatkówką.

Protokół

1. Ludzka tkanka płodowa

Wszystkie badania związane z tkankami ludzkimi są prowadzone zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej oraz wytycznymi instytucjonalnej komisji przeglądowej NIH. Gałki oczne płodów są pozyskiwane przez niezależnego dostawcę, Advanced Bioscience Resources (ABR, Alameda, CA), od przypadkowych dawców w 16. do 22. tygodnia ciąży, umieszczane w probówkach z medium RPMI-1640 (zapewnionych przez ABR), pakowane w lodzie i dostarczane priorytetową przesyłką nocną. Tkanki zachowują żywotność do 48 godzin po enukleacji.

2. Pożywka do hodowli komórkowej

Zmodyfikowane pożywka MEM-alpha (Sigma-Aldrich) jest stosowana jako baza do przygotowania pożywek zawierających 5% i 15% surowicy do hodowli komórek RPE (pożywka RPE; Tabela 1 poniżej).

Nazwa	Sigma	Gibco	Ilość	Przechowywanie
MEM, modyfikacja alpha	M-4526		500 mL	+4°C
Suplement N1	N-6530		5 mL	+4°C
Penicylina-streptomycyna		15140-148	5 mL	-20°C
GlutaMax - I		35050	5 mL	-20°C
Niezbędne aminokwasy	M-7145		5 mL	+4°C
THT*				-80°C
Tauryna	T-0625		125 mg
Hydrokortyzon	H-0396 10		10 μg
Trijodotyronina	T-5516		0.0065 μg
Płodowa surowica bydlęca**			5% lub 15%	-80°C

Tabela 1. Składniki pożywki dla ludzkiego płodowego RPE do przygotowania 500 mL pożywki

* THT przygotowuje się poprzez rozpuszczenie tauryny, hydrokortyzonu i trijodotyroniny w 1 1,5 mL PBS przed sporządzeniem pożywki. Przygotowuje się wiele aliquotów, które przechowuje się w temperaturze -80°C, aby uprościć przygotowanie pożywki hodowlanej.

** Płodowa surowica bydlęca nie pochodzi z firmy Sigma-Aldrich ani Gibco.

Płytkowe surowica bydlęca z płodów używana do przygotowania pożywek pochodzi z firmy Atlanta Biologicals (Norcross, GA). Każda butelka surowicy jest poddawana inaktywacji termicznej (56°C przez 1h) przed użyciem. Aby zapewnić spójność hodowli komórkowych, zakupiono duże ilości surowicy z tej samej partii, którą przechowywano w temperaturze -20°C do momentu przygotowania pożywek. Komórki hfRPE z konkretnej serii, wysiane przy niskiej gęstości, są hodowane przez kilka tygodni w płytkach 24- lub 12-dołkowych w pożywkach zawierających 20% FBS z różnych partii. Najszybciej rosnące, zmielanizowane komórki o najbardziej klasycznej morfologii RPE (brukowanej) wskazują na odpowiednią partię surowicy, którą można wykorzystać do hodowli komórkowych.

Pożywka do hodowli komórkowych zawiera również: suplement N1 (Sigma-Aldrich) 1:100 mL/mL, GlutaMax/penicylinę-streptomycynę 1:100 mL/mL (Gibco) oraz roztwór nieessentialnych aminokwasów (Sigma-Aldrich) 1:100 mL/mL. Dodatkowo, wcześniej przygotowuje się mieszaninę hydrokortyzonu (20 μg/L), tauryny (250 mg/L) i trijodotyroniny (0.013 μg/L) (THT) poprzez rozpuszczenie tych trzech składników w PBS do końcowego stężenia 1:500 (mL/mL). Alikwoty THT przechowuje się w temperaturze 80°C do momentu dodania do pożywki RPE.

3. Hodowla komórkowa

Po otrzymaniu nieuszkodzone gałki oczne płucze się w roztworze antybiotyków i antymikotyków (rozcieńczonym 10X; nr kat. 15240-096; Invitrogen) z dodatkiem gentamicyny (1 mg/mL) przez 3 do 5 minut (Rysunek 1 poniżej).

Rysunek 1. Po inkubacji antybiotyki płucze się dwukrotnie medium, takim jak HBSS lub PBS. Każdą gałkę oczną przenosi się pojedynczo do 10 cm szalki Petriego powleczonej Sylgard-184 (WPI) i stabilizuje igłami 27G. Za pomocą noża bocznego ClearCut (Alcon) wykonuje się nacięcie przez twardówkę poniżej ciała rzęskowego (1/3 odległości od równika oka do powierzchni przedniej). Nacięcie to służy do rozpoczęcia cięcia okrężnego w celu usunięcia przedniej części oka. Cięcie wykonuje się za pomocą zakrzywionych nożyczek do tęczówki z powłoką z węglika wolframu, z jednym ząbkowanym ostrzem (FST). Przed usunięciem przedniej części oka wykonuje się nacięcie przez ciało szkliste, aby uniknąć odwarstwienia siatkówki od RPE w biegunie tylnym. Po usunięciu przedniej części oka biegun tylny inkubuje się z roztworem dispazy-I (2 U/mL, nr kat. 04942086001; Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) w medium zawierającym 5% surowicy przez 40-60 minut w temperaturze 37°C i 5% CO₂. Po traktowaniu dispazą bieguny tylne przenosi się do HBSS w szalkach Petriego z silikonową wyściółką (Sylgard 184; Dow Corning, Midland, MI) i dzieli na ćwiadry lub większe fragmenty, aby odpowiednio spłaszczyć tkanki. Następnie delikatnie usuwa się siatkówkę za pomocą pęsety. Pojedyncze warstwy komórek RPE oddziela się w postaci płatów i zbiera bezpośrednio do zimnego roztworu trypsyny-EDTA (Gibco, #25200-056). Po zebraniu RPE probówki z tkankami w trypsynie-EDTA zamyka się i przenosi do łaźni wodnej na 10-15 min w temperaturze 37°C. Po 10 minutach inkubacji probówki energicznie wstrząsa się, aby rozdzielić RPE na małe skupiska. Jeśli rozdzielenie nie jest pełne, probówki umieszcza się ponownie w łaźni wodnej na kolejne 5 min. Po inkubacji w trypsynie-EDTA sprawdza się probówki pod kątem ewentualnych nierozpuszczonych mieszanych skupisk komórkowych. Wszelkie zaobserwowane skupiska usuwa się za pomocą szklanej pipety Pasteura o cienkiej końcówce. Po wirowaniu (1,4 rpm w wirówce klinicznej przez 4 min), komórki hfRPE resuspendsuje się w 15% medium RPE, a następnie przenosi do kolb Primaria (przykład: nr kat. 08-772-45; Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Medium to wymienia się po 1 dniu na medium RPE zawierające 5% surowicy, a kolejne wymiany przeprowadza się co 2 do 3 dni. Po 3 do 4 tygodniach komórki osiągają konfluencję i stają się jednorodnie spigmentowane. Następnie poddaje się je trypsynizacji w 0,25% trypsynie-EDTA przez 10 do 15 minut, resuspendsuje w medium do hodowli komórek RPE zawierającym 15% surowicy i wysiewa na przezroczyste inserty do hodowli komórek w zagęszczeniu 150 do 200 tys. komórek na studnię (Transwell; Corning Costar, Corning, NY), stosując inserty o średnicy 12 mm, porach 0,4 µm i membranach poliestrowych (przykład: nr kat. 07-200-161, Fisher Scientific). Przed wysiewaniem studnie powleka się ludzką macierzą zewnątrzkomórkową (10 μg w 150 μL HBSS na studnię, nr kat. 354237; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) i utwardza światłem UV w dygestorze przez 2 godziny. W niektórych przypadkach procedurę trypsynizacji powtarzano drugi raz, aby zebrać komórki, które nie oddzieliły się po pierwszej trypsynizacji. Ten sam protokół (z wyłączeniem powlekania ECM) stosowano do hodowli komórek w kolbach w celu wygenerowania populacji komórek P1. Komórki te wykorzystywano w eksperymentach, gdy ich całkowita oporność tkankowa wynosiła ≥ 200 Ω•cm² i były one jednorodnie spigmentowane.

Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększony rysunek 1.

4. Procedury krok po kroku

1. Przygotować płytkę 12-dołkową z wieloma roztworami (na każde oko wymagane są 4 dołki):
   1. dodać 10-krotny roztwór antybiotyk-antymykotyk – 1 dołek/oko
   2. dodać roztwór PBS/HBSS do płukania – 2 dołki/oko
   3. dodać roztwór dispazy – 1 dołek/oko
2. Przygotować szalkę Petriego do dyssekcji, rozpakowując 5 igieł mocujących i napełniając szalkę HBSS
3. Wyjąć oczy z opakowań i umieścić je w roztworze antybiotyk-antymykotyku na 3-5 min (przygotowanym w kroku 1)
4. Wypłukać oczy w dwóch dołkach (przygotowanych w kroku 1) za pomocą PBS/HBSS, a następnie przenieść je do szalki do dyssekcji.
5. Usunąć nadmiar mięśni i tkanek łącznych wokół oka
6. Za pomocą igieł 27G unieruchomić (przypiąć do silikonowej podstawy) oczy w szalce do dyssekcji, ustawiając je tak, aby rogówka była skierowana ku górze.
7. Za pomocą noża bocznego wykonać nacięcie poniżej rogówki, w miejscu, w którym rozpocznie się cięcie okrężne
8. Za pomocą nożyczek irydowych wykonać cięcie wokół oka, a następnie tymi samymi nożyczkami przeciąć ciało szkliste i unieść przednią część oka.
   Uwaga: w krokach od 3 do 8 należy unikać nadmiernego nacisku mechanicznego na gałkę oczną.
9. Przenieść otwarte oko do roztworu dispazy (przygotowanego w kroku 1)
10. Inkubować czaszkę gałki ocznej przez 40-60 minut w temperaturze 37°C przy 5 % CO₂
11. Wymienić roztwór HBSS w szalce do dyssekcji na świeży.
12. Przenieść oko z roztworu dispazy do szalki do dyssekcji.
13. Ułożyć oko w szalce Petriego (czaszką gałki ocznej skierowaną ku górze) i unieruchomić dwiema igłami 27G.
14. Delikatnie unieść częściowo oddzieloną siatkówkę i za pomocą nożyczek do siatkówki odciąć ją od nerwu wzrokowego. Usunąć siatkówkę.
15. Za pomocą nożyczek irydowych wykonać jedno nacięcie od obwodu oka w kierunku nerwu wzrokowego.
16. Za pomocą wszystkich pięciu igieł 27G spłaszczyć oko, tak aby warstwa RPE była dobrze rozciągnięta.
17. Za pomocą nożyczek do siatkówki wykonać cięcie okrężne wokół nerwu wzrokowego, oddzielając warstwę RPE od miejsca przyczepu do nerwu wzrokowego.
    Uwaga: kroki 13-17 można wykonać przy niskim powiększeniu lub bez użycia stereomikroskopu
18. Ustawić stereomikroskop na powiększenie 250x lub większe i zlokalizować krawędź arkusza RPE blisko nerwu wzrokowego wzdłuż nacięcia wykonanego nożyczkami irydowymi.
19. Za pomocą dwóch pęset oddzielić błonę RPE-Bruch'a od warstwy tkanki naczyniówki. Może to wymagać kilku prób w celu znalezienia obszaru wzdłuż krawędzi, gdzie połączenie RPE i naczyniówki jest najsłabsze.
20. Umieścić arkusze RPE w zimnym roztworze trypsyny-EDTA w probówce 15 mL
21. Po zebraniu RPE zakręcić probówki z tkankami w trypsynie-EDTA i przenieść je do kąpieli wodnej na 10-15 min w temperaturze 37°C.
22. Po 10 min inkubacji energicznie potrząsnąć probówkami 15 mL, aby rozdzielić RPE na małe skupiska. Jeśli rozdział nie jest pełny, umieścić probówki ponownie w kąpieli wodnej na kolejne 5 min.
23. Sprawdzić probówki pod kątem ewentualnych nierozpuszczonych mieszanych skupisk komórek. Wszelkie zaobserwowane skupiska należy usunąć za pomocą szklanej pipety Pasteura z cienkim końcem.
24. Odwirować (1,4 rpm w wirówce klinicznej przez 4 min) komórki hfRPE, usunąć supernatant i resuspenderować komórki w 15% pożywce RPE (łącznie 9 mL)
25. Wlać 3 mL zawiesiny komórkowej do kolb Primaria, dodać 2 mL świeżej 15% pożywki RPE i umieścić kolbę w inkubatorze do następnego dnia (37°C, 5% CO₂)

5. Reprezentatywne wyniki

Walidacja funkcjonalna hodowli komórek hfRPE

W poprzednich eksperymentach wykorzystaliśmy te kultury pierwotne do określenia ekspresji, polaryzacji i funkcji białek transportowych błony plazmatycznej oraz do zidentyfikowania konkretnych szlaków sygnałowych regulujących funkcję RPE ^1-11. Zebrane cechy te stanowią zestaw walidacyjny właściwości, które można zastosować do każdej generacji komórek. Opisane poniżej eksperymenty identyfikują białka odpowiedzialne za transepitelialny transport płynów oraz integralność drogi parakomórkowej. Eksperymenty te, przeprowadzone in vitro, zostały zwalidowane w modelu zwierzęcym ponownego przytwierdzenia siatkówki ⁶.

Rycina 2. Lokalizacja CFTR w komórkach hfRPE. Panel górny lewy: CFTR wykryto w komórkach hfRPE przy użyciu ekstraktów wzbogaconych w białka błonowe. M, marker masy cząsteczkowej; ścieżka 1, główna forma dojrzała (prążek C) oraz niedojrzała (prążki A i B). Panel dolny środkowy: lokalizacja CFTR metodą immunofluorescencji (oznaczenie zielone). Panel prawy górny: powiększony widok przekroju w płaszczyźnie z przedstawiający projekcję maksymalnej intensywności wzdłuż osi z. ZO-1 (oznaczone na czerwono) służy jako marker połączeń ścisłych, wyznaczający stronę apikalną i bazolateralną RPE. DAPI (niebieski) barwi jądra komórkowe zlokalizowane blisko błony podstawnej. ZO-1 pojawia się jako kolor żółto-pomarańczowy, ponieważ jego czerwone oznaczenie nakłada się na zieloną fluorescencję CFTR.

Rycina 3. Fizjologiczne zmiany wywołane przez IFNγ w hfRPE. A: Dodanie IFNγ do kąpieli podstawnej zwiększyło transepitelialny transport płynów (Jv) przez monowarstwę pierwotnych, hodowanych komórek hfRPE. Jv przedstawiono jako funkcję czasu na górnym wykresie, gdzie wartości dodatnie oznaczają netto absorpcję płynów (z kąpieli apikalnej do podstawnej); potencjał transepitelialny (TEP) oraz całkowity opór tkanki (R_T) przedstawiono jako funkcję czasu na dolnych wykresach. B: Dodanie CFTRinh-172(5 μM) do kąpieli podstawnej zahamowało stymulowany przez IFNγ wzrost Jv.

Poniżej przedstawiono przykład eksperymentów na modelach zwierzęcych potwierdzających wyniki uzyskane dla hfRPE in vitro. W tym eksperymencie sztucznie wywołane odwarstwienie siatkówki zostało znacząco zredukowane po dodaniu IFNg do zewnętrznej powierzchni oka (Rysunek 4 A,B). Efekt ten może być częściowo zablokowany przez: (1) dodanie blokera cAMP (Rysunek 4D); (2) całkowicie zablokowany po dodaniu blokerów JAK⁺cAMP. Obrazy poniżej zostały uzyskane przy użyciu skanera OCT.

Rysunek 4. Eksperymenty in vivo dotyczące odwarstwienia siatkówki. Procedury dla tych eksperymentów in vivo zostały wcześniej opisane szczegółowo ⁶. W tych eksperymentach odwarstwienia siatkówki wywołano w oku szczura poprzez wstrzyknięcie 0,5-3 μL zmodyfikowanego roztworu PBS do przestrzeni podsiatkówkowej (SRS), samodzielnie lub w połączeniu z inhibitorami szlaków JAK-STAT i PKA. Każdy eksperyment obejmował początkowy okres kontrolny trwający 40-70 min po wywołaniu odwarstwienia siatkówki. W tym czasie mierzono tempo zmiany objętości pęcherzyka, aby zapewnić jego stabilność. Do pomiaru przebiegu czasowego zmiany objętości w SRS wykorzystano obrazowanie w tomografii optycznej koherencyjnej (Institute of Applied Physics, Russian Academy of Science, Nizhniy Novgorod, Rosja).

Przebieg zmian objętości ponownego przylegania mierzono za pomocą obrazowania optycznej koherencji (OCT). Obrazy OCT z 4 różnych eksperymentów (panele po lewej; A-D) pokazują zmianę rozmiarów odwarstwienia (strzałki w A, B i D) po dodaniu IFNγ na powierzchnię przednią przez 40-70 min. Panele A i B pokazują, że IFNγ zwiększył Jv z poziomu kontrolnego (≈ 2 μl•cm²•hr^-1) odpowiednio do 14 i 12 μl•cm²•hr-1. Po dodaniu inhibitorów szlaku JAK-STAT oraz PKA (C i D), indukowane przez IFNγ tempo absorpcji zostało znacznie zredukowane odpowiednio do 0,2 i 7,9 μl•cm²•hr-1. Strzałki wskazują granicę pęcherzyka w porównaniu z obszarem zamkniętym w przerywanej linii (objętość początkowa). Prawa strona rysunku: górny panel – podsumowanie zmierzonych wartości Jv z kilku eksperymentów; środkowy panel – film (kliknij tutaj); dolny panel – przekroje 3D eksperymentu podsumowanego w B. Kolor pseudobarwny niebieski wskazuje zasięg przestrzenny odwarstwienia w czasie t = 0 oraz 40 min po dodaniu INFγ.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z oświadczeniem Association for Research in Vision and Ophthalmology. Protokół został zatwierdzony przez Animal Care and Use Committee National Institutes of Health.

Dyskusja

W niniejszych eksperymentach opisujemy dodatkowe modyfikacje naszych wcześniej opublikowanych technik ³, zaprojektowane w celu usprawnienia licznych etapów niezbędnych do uzyskania powtarzalnych pierwotnych kultur hfRPE z większą liczbą dostępnych komórek z jednego oka. Każda zmiana w pierwotnej procedurze została rygorystycznie przetestowana w wielu eksperymentach z zakresu fizjologii i biologii molekularnej, aby upewnić się, że modyfikacje te nie wprowadziły artefaktów, a następnie była ona stale weryfikowana przez wiele innych laboratoriów wykorzystujących te komórki. Na koniec przeprowadzono dodatkowe eksperymenty w celu porównania wyników in vitro z podobnymi zaburzeniami w modelach zwierzęcych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Instrumenty niezbędne do protokołu sekcji
Stereomikroskop – dowolny z dostępnym powiększeniem x250 wymaganym do sekcji
Szalka do sekcji – np. Kimble 100 x 20mm #23062 (jedna na sekcję) z dowolnego źródła
Sylgard 184 – WPI Kat. #SYLG184*
* Aby przygotować szalkę do sekcji, należy postępować zgodnie z dołączoną instrukcją mieszania Sylgard 184, wlać wymieszany ciekły elastomer do szalki Petriego, tworząc warstwę o grubości 5-8mm. Pozostawić elastomer do utwardzenia przez co najmniej 24h. Szalka z utwardzonym elastomerem może być sterylizowana 70% etanolem i używana wielokrotnie (~100 razy)
Igły 27 G z B-D PrecissionGlide 1¼ długości (5 na sekcję) z dowolnego źródła
Roztwór HBSS 1X zawierający sole Ca i Mg – GIBCO Kat.#14025 500ml (nadaje się do wielu sekcji)
Nożyczki tęczowe (Iris), ostrze węglikowe ząbkowane, zakrzywione – FST Kat.# 14559-11 (jedne)
Nożyczki siatkówkowe – Katena Kat.#K4-5300 (jedne)
Pinceta – np. pęseta Dumont #5 z polerowanymi końcówkami z WPI Kat.#500085 (2 sztuki)
Nóż do bocznego nacięcia (Sideport knife) – Alcon, ClearCut 1mm, podwójna ścięcie, kątowy Kat.#8065921540
Probówka do wirowania 15ml – (jedna na oko) z dowolnego źródła
Szklana pipeta Pasteura – (jedna na sekcję) z dowolnego źródła
Płytka 12-dołkowa (jedna na sekcję) z dowolnego źródła
Kolba Primaria 25cm2 – (2-3 na oko) z dowolnego źródła