Modele eksperymentalne do badania fizjologii i patofizjologii nabłonka barwnikowego siatkówki

Podsumowanie

Zapewniamy powtarzalną metodę hodowli zlewających się monowarstw komórek nabłonka barwnikowego ludzkiego płodu siatkówki (hfRPE), które wykazują morfologię, fizjologię, polaryzację oraz wzorce ekspresji białek i genów w dorosłej tkance natywnej. Praca ta została rozszerzona na zwierzęcy model kilku chorób oczu.

Streszczenie

Opracowaliśmy procedurę hodowli komórkowej, która może wytwarzać duże ilości zlewających się monowarstw pierwotnych kultur ludzkiego płodu z nabłonka barwnikowego siatkówki (hfRPE) z morfologicznymi, fizjologicznymi i genetycznymi cechami rodzimego ludzkiego RPE. Te hodowle komórek hfRPE wykazują ciężką pigmentację, a mikroskopia elektronowa wykazuje rozległe mikrokosmki błony wierzchołkowej. Kompleksy połączeniowe zidentyfikowano za pomocą znakowania immunofluorescencyjnego różnych białek połączeń ścisłych. Polaryzacja i funkcja nabłonka tych łatwych do odtworzenia kultur pierwotnych bardzo przypominają wcześniej badane modele rodzimych RPE u ssaków, w tym u człowieka. Wyniki te zostały rozszerzone poprzez opracowanie interwencji terapeutycznych w kilku zwierzęcych modelach chorób oczu u ludzi. Skupiliśmy się na strategiach usuwania nieprawidłowego nagromadzenia płynu w przestrzeni siatkówki lub podsiatkówkowej. Zewnątrzkomórkowa przestrzeń podsiatkówkowa oddziela zewnętrzne segmenty fotoreceptora i błonę wierzchołkową RPE i ma kluczowe znaczenie dla utrzymania przyczepów siatkówki i całego szeregu interakcji RPE / siatkówka.

Protokół

1. Ludzka tkanka płodowa

Wszystkie badania związane z tkankami ludzkimi są zgodne z założeniami Deklaracji Helsińskiej i instytucjonalnej komisji rewizyjnej NIH. Oczy płodu są pozyskiwane przez niezależnego zamawiającego, Advanced Bioscience Resources (ABR, Alameda, CA), od losowych dawców w 16 do 22 tygodniu ciąży, umieszczane w pożywkach zawierających probówki RPMI-1640 (dostarczone przez ABR), pakowane w lód i dostarczane przez usługę priorytetowej dostawy w nocy. Tkanki zachowują żywotność do 48 godzin po wyłuszczeniu.

2. Pożywka do hodowli komórkowych

Pożywka modyfikowana MEM-alfa (Sigma-Aldrich) jest używana jako podłoże bazowe do przygotowania 5% i 15% pożywki zawierającej surowicę do hodowli komórek RPE (pożywka RPE; Tabela 1 poniżej).

nazwa Sigma Gibco (firma Gibco) kwota składowanie MEM, modyfikacja alfa M-4526 powiedział:   500 ml +4°C Suplement N1 N-6530   5 ml +4°C Penicylina-streptomycyna   Nr kat. 15140-148 5 ml -20°C GlutaMax - I   Numer katalogowy: 35050 5 ml -20°C Aminokwasy endogenne Zobacz materiał M-7145   5 ml +4°C THT*       -80°C tauryna T-0625   125 mg tabletki powlekania   Hydrokortyzon H-0396 10   10 μg   Trójjodo-tyronina T-5516   0,0065 μg   Surowica bydlęca płodu**     5% lub 15% -80°C

Tabela 1. Pożywka dla płodu ludzkiego Składniki pożywki RPE do przygotowania pożywki o pojemności 500 ml

* THT jest wytwarzany przez rozpuszczenie tauryny-hydrokortyzonu-trijodo-tyroniny w 1 1,5 ml PBS przed sporządzeniem pożywki. Wytwarza się wiele podwielokrotności i przechowuje je w temperaturze -80°C, aby uprościć przygotowanie pożywki hodowlanej.

** Surowica bydlęca płodu nie jest uzyskiwana od Sigma-Aldrich ani Gibco.

Surowica bydlęca używana do przygotowania pożywek jest pozyskiwana z Atlanta Biologicals (Norcross, GA). Każda butelka serum jest inaktywowana termicznie (56°C przez 1 godzinę) przed użyciem. Aby zapewnić spójność hodowli komórkowej, kupuje się duże ilości surowicy z tej samej partii i przechowuje się je w temperaturze -20°C do czasu wykorzystania ich do przygotowania pożywki. Słabo obsiane komórki z określonej partii komórek hfRPE są hodowane na 24- lub 12-dołkowych płytkach przez kilka tygodni na pożywkach zawierających 20% FBS z różnych partii. Najszybciej rosnące melanizowane komórki o najbardziej klasycznej morfologii RPE (kostka brukowa) wskazują na odpowiednią partię surowicy, którą można wykorzystać do hodowli komórek.

Pożywka do hodowli komórkowych zawiera również: suplement N1 (Sigma-Aldrich) 1:100 mL/mL, GlutaMax/ penicylina-streptomycyna 1:100 mL/ml (Gibco) i nieistotny roztwór aminokwasów (Sigma-Aldrich) 1:100 mL/ml. Ponadto hydrokortyzon (20 μg/l), tauryna (250 mg/l) i trójjodotyronina (0,013 μg/l) (THT) są przygotowywane z wyprzedzeniem poprzez rozpuszczenie tych trzech składników w PBS do końcowego stężenia 1:500 (ml/ml). Podwielokrotności THT są przechowywane w temperaturze 80°C do momentu dodania do podłoża RPE.

3. Hodowla komórkowa

Po otrzymaniu, nienaruszone kule są płukane w antybiotykowym roztworze przeciwgrzybiczym (rozcieńczonym do 10X; nr kat. 15240-096; Invitrogen) z gentamycyną (1 mg/ml) przez 3 do 5 minut (ryc. 1 poniżej).

Rysunek 1. Po inkubacji antybiotyki spłukuje się dwukrotnie pożywką, taką jak HBSS lub PBS. Jedna gałka oczna w tym czasie jest przenoszona na 10 cm szalkę Petriego z pokrytą Sylgard-184 (WPI) i zabezpieczoną igłami 27G. Za pomocą noża ClearCut sideport knife (Alcon) wykonuje się nacięcie przez twardówkę poniżej ciała rzęskowego (1/3 odległości od równika oka do powierzchni przedniej). To nacięcie służy do rozpoczęcia okrągłego cięcia w celu usunięcia przedniej części oka. To cięcie jest wykonywane za pomocą zakrzywionych nożyczek tęczówkowych pokrytych węglikiem wolframu z jednym ostrzem ząbkowanym (FST). Przed usunięciem przedniej części oka wykonuje się nacięcie przez ciało szkliste, aby uniknąć oderwania siatkówki od RPE na tylnym biegunie. Po usunięciu przedniej części oka, tylny biegun inkubuje się z roztworem dypazy-I (2 U/ml, nr kat. 04942086001; Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) w 5% surowicy zawierającej pożywkę przez 40-60 minut w 37°C-5% CO₂. Po leczeniu dyspazą, tylne bieguny są przenoszone do HBSS na szalkach Petriego z silikonową wyściółką (Sylgard 184; Dow Corning, Midland, MI) i rozcięte na ćwiartki lub większe kawałki, aby wystarczająco spłaszczyć tkanki. Następnie siatkówkę delikatnie usuwa się kleszczami. Jednokomórkowe warstwy RPE zostały oderwane w arkuszach i zebrane bezpośrednio do zimnego roztworu trypsyny-EDTA (Gibco, #25200-056). Po pobraniu RPE probówki z tkankami w trypsyno-EDTA są zamykane i przenoszone do łaźni wodnej na 10-15 minut w temperaturze 37°C. Po 10 minutach inkubacji probówki są energicznie wstrząsane, aby rozdzielić RPE na małe grona. Jeśli separacja nie zostanie zakończona, probówki umieszcza się z powrotem w łaźni wodnej na kolejne 5 minut. Po inkubacji trypsyny-EDTA probówki są sprawdzane pod kątem ewentualnych nierozpuszczonych klastrów komórek mieszanych. Wszelkie zaobserwowane skupiska są usuwane za pomocą pipety Pasteura z cienką końcówką. Po odwirowaniu (1,4 obr./min na wirówce klinicznej przez 4 minuty) komórki hfRPE są ponownie zawieszane w 15% pożywce RPE, a następnie umieszczane w kolbach Primaria (przykład: nr kat. 08-772-45; Fisher Scientific, Pittsburgh, Pensylwania). Pożywkę tę zastępuje się po 1 dniu 5% pożywką RPE zawierającą surowicę, a kolejne zmiany dokonywano co 2 do 3 dni. Po 3 do 4 tygodniach komórki stały się zlewające się i jednolicie pigmentowane. Następnie są trypsynizowane w 0,25% trypsyny-EDTA przez 10 do 15 minut, ponownie zawieszane w 15% pożywce do hodowli komórek RPE zawierającej surowicę i wysiewane na przezroczystych wkładkach do hodowli komórkowych w ilości od 150 do 200 tys. komórek na studzienkę (Transwell; Corning Costar, Corning, NY), przy użyciu wkładek o średnicy 12 mm, porów 0,4 μm, membran poliestrowych (przykład: nr kat. 07-200-161, Fisher Scientific). Przed wysiewem studzienki pokryto ludzką macierzą zewnątrzkomórkową (10 μg w 150 μL HBSS na studzienkę, nr kat. 354237; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) i utwardzane światłem UV w kapturze przez 2 godziny. W niektórych przypadkach procedurę trypsynizacji powtarzano po raz drugi, aby zebrać komórki, które nie odczepiły się po pierwszej trypsynizacji. Ten sam protokół (z wyłączeniem powlekania ECM) zastosowano do hodowli komórek na kolbach w celu wygenerowania populacji komórek P1. Komórki te wykorzystano w eksperymentach, gdy ich całkowita oporność tkankowa wynosiła ≥ 200 Ω^cm2 i były jednolicie zabarwione.

Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy rysunek 1.

4. Procedury krok po kroku

1. Przygotuj 12-dołkową płytkę z wieloma roztworami (na każde oko potrzebne są 4 dołki):
   1. Dodaj 10x antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy - 1 dołek/oko
   2. dodać roztwór PBS/HBSS do płukania - 2 studzienki/oko
   3. Dodaj roztwór dyspazy - 1 dołek/oko
2. Przygotuj szalkę Petriego do preparowania, rozpakowując 5 igieł mocujących i wypełniając ją HBSS
3. Rozpakuj oczy i umieść je w roztworze antybiotykowo-przeciwgrzybiczym na 3-5 minut (przygotowanym w kroku 1)
4. Przepłukać oczy w dwóch studzienkach (przygotowanych w kroku 1) za pomocą PBS/HBSS, a następnie przenieść je do naczynia preparacyjnego.
5. Przytnij nadmiar mięśni i tkanek łącznych wokół oka
6. Za pomocą igieł 27G zabezpiecz (przypnij do silikonowej podstawy) oczy w naczyniu preparacyjnym, wyrównując je w taki sposób, aby rogówka była skierowana do góry.
7. Za pomocą noża bocznego wykonaj nacięcie poniżej rogówki, gdzie rozpocznie się okrągłe cięcie
8. Za pomocą nożyczek do tęczówki wykonaj cięcie wokół oka, a następnie tymi samymi nożyczkami przetnij ciało szkliste i odsuń przednią część oka.
   Uwaga: w krokach od 3 do 8 należy unikać nadmiernego mechanicznego nacisku na gałkę oczną.
9. Przenieść otwarte oko do roztworu do dyspazy (przygotowanego w kroku 1)
10. Inkubować muszlę oczną przez 40–60 minut w temperaturze 37°C z 5 % CO₂
11. Zastąp roztwór HBSS w naczyniu preparacyjnym świeżym.
12. Przenieść oko z roztworu dyspazy do naczynia preparacyjnego.
13. Umieść oko na szalce Petriego (miseczka oczna skierowana do góry) i zabezpiecz dwiema igłami 27G.
14. Delikatnie unieś częściowo oddzieloną siatkówkę i za pomocą nożyczek siatkówkowych odetnij siatkówkę od nerwu wzrokowego. Wyrzuć siatkówkę.
15. Za pomocą nożyczek do tęczówki wykonaj jedno nacięcie od obwodu oka w kierunku nerwu wzrokowego.
16. Używając wszystkich pięciu igieł 27G, spłaszcz oczko, dzięki czemu warstwa RPE jest ładnie rozciągnięta.
17. Za pomocą nożyczek do siatkówki wykonaj okrągłe nacięcie wokół nerwu wzrokowego, oddzielając warstwę RPE od przyczepu do nerwu wzrokowego.
    Uwaga: kroki 13-17 można wykonać przy małym powiększeniu lub bez mikroskopu stereoskopowego
18. Dostosuj mikroskop stereoskopowy do powiększenia 250x lub większego i znajdź krawędź arkusza RPE blisko nerwu wzrokowego wzdłuż cięcia wykonanego nożyczkami do tęczówki.
19. Za pomocą dwóch kleszczyków oddzielić błonę RPE-Bruch od warstwy tkanki naczyniówkowej. Może to wymagać kilku prób znalezienia obszaru wzdłuż krawędzi, w którym połączenie RPE i naczyniówki jest najsłabsze.
20. Umieść arkusze RPE w zimnym roztworze trypsyny-EDTA w probówce o pojemności 15 ml
21. Po pobraniu RPE zakryj i przenieś probówki z tkankami w trypsyno-EDTA do łaźni wodnej na 10-15 minut w temperaturze 37°C.
22. Po 10 minutach inkubacji energicznie wstrząśnij probówkami o pojemności 15 ml, aby rozdzielić RPE na małe grona. Jeśli separacja nie jest kompletna, umieść probówki z powrotem w łaźni wodnej na kolejne 5 minut.
23. Sprawdź probówki pod kątem ewentualnych nierozpuszczonych skupisk komórek mieszanych. Wszelkie zaobserwowane skupiska należy usunąć za pomocą pipety Pasteura z cienką końcówką.
24. Odwirować (1,4 obr./min na wirówce klinicznej przez 4 minuty) komórki hfRPE, usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce 15% RPE (łącznie 9 ml)
25. Umieścić 3 ml zawiesiny komórek w kolbach Primaria, dodać 2 ml świeżej pożywki 15% RPE, umieścić kolbę w inkubatorze do następnego dnia (37°C, 5% CO₂)

5. Reprezentatywne wyniki

Walidacja funkcjonalna hodowli komórkowej hfRPE

W poprzednich eksperymentach używaliśmy tych pierwotnych kultur do określenia ekspresji, polaryzacji i funkcji białek transportujących błonę plazmatyczną oraz zidentyfikowania specyficznych szlaków sygnałowych, które regulują funkcję RPE ^1-11 Te cechy, gdy są akumulowane, dostarczają zestawu walidacji właściwości, które można zastosować do każdej generacji komórek. Eksperymenty podsumowane poniżej identyfikują białka, które determinują transnabłonkowy transport płynu i integralność szlaku parakomórkowego. Te eksperymenty in vitro zostały zweryfikowane w zwierzęcym modelu ponownego przyczepiania siatkówki ⁶.

Rysunek 2. Lokalizacja CFTR w komórkach hfRPE. Lewy górny panel: CFTR wykryto w komórkach hfRPE przy użyciu ekstraktów wzbogaconych w błonę. M, marker masy cząsteczkowej; tor 1, główny dojrzały (pasmo C) i niedojrzały (pasma A i B). Środkowy dolny panel: immunofluorescencyjna lokalizacja CFTR (zielona etykieta). Prawy górny panel: powiększony przekrój poprzeczny przez płaszczyznę z pokazujący rzut maksymalnej intensywności przez oś z. ZO-1 (oznaczony jako czerwony) służy jako znacznik ścisłego połączenia wyznaczający wierzchołkową i podstawno-boczną stronę RPE. DAPI (niebieski) oznacza jądra znajdujące się blisko błony podstawnej. ZO-1 jest żółty/pomarańczowy, ponieważ jego czerwona etykieta nakłada się na zieloną fluorescencję z CFTR.

Rysunek 3. Zmiany fizjologiczne w hfRPE wywołane przez IFNγ. A: dodanie IFNγ do kąpieli podstawowej zwiększyło transnabłonkowy transport płynu (Jv) przez monowarstwę pierwotnych, hodowanych komórek hfRPE. Jv wykreśla się jako funkcję czasu w górnym śladzie, a absorpcja płynów netto (od kąpieli wierzchołkowej do podstawowej) jest wskazywana przez wartości dodatnie; potencjał przeznabłonkowy (TEP) i całkowita oporność tkanek (R_T) są wykreślane jako funkcja czasu w dolnych śladach. B: Dodanie CFTRinh-172 (5 μM) do kąpieli podstawowej zahamowało stymulowany przez IFNγ wzrost Jv.

Poniżej znajduje się przykład eksperymentów na modelach zwierzęcych potwierdzających wyniki hfRPE in vitro. W tym eksperymencie sztucznie utworzone odwarstwienie siatkówki zostało znacznie zmniejszone po dodaniu IFNg do zewnętrznej powierzchni oka (ryc. 4 A, B). Efekt ten można częściowo zablokować poprzez: (1) dodanie blokera cAMP (rysunek 4D); (2) całkowicie zablokowane po dodaniu blokerów ^JAK+cAMP. Poniższe obrazy uzyskano za pomocą skanera OCT.

Rysunek 4. Eksperymenty in vivo z odwarstwieniem siatkówki. Procedury przeprowadzania tych eksperymentów in vivo zostały ^{wcześniej szczegółowo opisane} 6. W tych eksperymentach odwarstwienia siatkówki powstały w oku szczura przez wstrzyknięcie 0,5-3 μl zmodyfikowanego roztworu PBS do przestrzeni podsiatkówkowej (SRS), samodzielnie lub z kombinacją inhibitorów szlaku JAK-STAT i PKA. Każdy eksperyment miał początkowy okres kontrolny wynoszący 40-70 minut po utworzeniu odwarstwienia siatkówki. W tym czasie mierzono szybkość zmian objętości pęcherzyka, aby zapewnić stabilność pęcherzyka. Obrazowanie za pomocą optycznej koherentnej tomografii (Instytut Fizyki Stosowanej, Rosyjska Akademia Nauk, Niżny Nowogród, Rosja) wykorzystano do pomiaru przebiegu w czasie zmiany objętości SRS.

Przebieg czasowy zmiany objętości ponownego przystawienia został zmierzony za pomocą optycznej koherentnej tomografii (OCT). Obrazy OCT z 4 różnych eksperymentów (panele po lewej; A-D), które pokazują zmianę wielkości oderwania (strzałki w A, B i D) po dodaniu IFNγ do przedniej powierzchni przez 40-70 min. Panele A i B pokazują, że IFNγ zwiększył Jv ze swojego wskaźnika kontrolnego (≈ 2 μl•cm²•^hr-1) do 14 i 12 μl•cm²•hr-1, odpowiednio. Po dodaniu szlaku JAK-STAT i inhibitorów PKA (C i D), szybkość wchłaniania indukowanego przez IFNγ została znacznie zmniejszona odpowiednio do 0,2 i 7,9 μl•cm²•hr-1. Strzałki wskazują granicę pęcherza dla porównania z obszarem zamkniętym w linii przerywanej (objętość początkowa). Prawa strona rysunku: górny panel - podsumowanie zmierzonych wskaźników Jv z kilku eksperymentów; Panel środkowy - film (kliknij tutaj); dolny panel - sekcje 3D eksperymentu podsumowane w B. Pseudokolor w kolorze niebieskim wskazuje przestrzenny zasięg oderwania w t = 0 i 40 min po dodaniu INFγ.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z oświadczeniem Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką. Protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Narodowych Instytutów Zdrowia.

Dyskusja

W niniejszych eksperymentach opisujemy dodatkowe modyfikacje naszych wcześniej opublikowanych technik ³ mające na celu usprawnienie wielu kroków potrzebnych do wytworzenia spójnych kultur pierwotnych hfRPE z większą liczbą dostępnych komórek na oko. Każda zmiana w oryginalnej procedurze została rygorystycznie przetestowana w wielu eksperymentach z zakresu fizjologii i biologii molekularnej, aby upewnić się, że zmiany nie wprowadzają artefaktów i są stale testowane przez wiele innych laboratoriów wykorzystujących te komórki. Na koniec przeprowadzono dodatkowe eksperymenty w celu porównania wyników in vitro z podobnymi zaburzeniami w modelach zwierzęcych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Instrumenty potrzebne do protokołu preparacji
Mikroskop stereoskopowy - dowolny dostępny z powiększeniem roboczym x250 potrzebne do preparacji
Czasza preparująca - np. Kimble 100 x 20mm #23062 (jedna na preparację) dowolne źródło
Sylgard 184 - WPI Kat. #SYLG184*
* Aby przygotować naczynie preparacyjne, postępuj zgodnie z instrukcją mieszania Sylgard 184, wlej zmieszany płynny elastomer do szalki Petriego, aby utworzyć warstwę 5-8 mm. Pozostaw elastomer do utwardzenia przez co najmniej 24 godziny. Naczynie z utwardzonym elastomerem może być sterylizowane przy użyciu 70% etanolu i wielokrotnie używane (~100 razy)
Igły 27 G od B-D PrecissionGlide 1¼ długość (5 na rozwarstwienie) dowolne źródło
HBSS 1X Roztwór zawierający sole Ca i Mg - GIBCO Cat.#14025 500ml (dobre do wielokrotnych rozwarstwień)
Nożyczki do tęczówki ząbkowane ostrze z węglika spiekanego, zakrzywione - FST Cat.# 14559-11 (jeden)
Nożyczki do siatkówki - Katena Cat.#K4-5300 (one)
Kleszcze - np. Dumont Tweezers #5 z polerowanymi końcówkami od WPI Cat.#500085 (2 sztuki)
Nóż Sideport - Alcon, ClearCut 1mm, Dual Bevel, kątowy Kat.#8065921540
Probówka wirówkowa 15ml - (jedna na oko) dowolne źródło
Pipeta szklana Pasteura - (jedna na preparację) dowolne źródło
Płytka 12 studzienek (jedna na rozwarstwienie) dowolne źródło
Kolba Primaria 25cm2 - (2-3 na oko) dowolne źródło