Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Rezonans magnetyczny
- Zastosuj MRI, gdy rozmiar guza wynosi około 5 - 7 mm średnicy, zwykle 2 ~ 4 tygodnie po implantacji komórek. Użyj skanera MR dedykowanego do obrazowania małych zwierząt lub klinicznego skanera MR wyposażonego w specjalistyczną cewkę do obrazowania małych zwierząt.
nuta: Użyliśmy skanera MR dla małych zwierząt o masie 9,4 T z kombinacją rezonatora/nadajnika objętościowego 1H i odbiornika cewki powierzchniowej (o średnicy 30 mm) (Bruker BioSpin Corp., Billerica, MA). Cewka powierzchniowa zapewnia lepszy stosunek sygnału do szumu (SNR).
- Przygotuj środek kontrastowy MRI na bazie gadolinu do wstrzyknięcia ~0,1 - 0,2 mmol/kg każdemu zwierzęciu w ~0,1 - 0,2 ml PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami).
nuta: Stosowaliśmy gadoteridol i wstrzykiwaliśmy 0,2 mmol/kg w 0,15 ml PBS przez okres 15 sekund (0,1 ml/s).
- Przygotuj rurkę z mikropolietylenu (długość: 7,62 mm, średnica wewnętrzna: 0,28 mm, średnica zewnętrzna: 0,64 mm). Włóż igłę 30 G (o długości 12.7 mm) do jednego końca tuby, a igłę o końcówce 30 G (o długości 9.5 mm) do drugiego końca. Podłączyć strzykawkę o pojemności 1 ml zawierającą środek kontrastowy MR do igły z końcówką i powoli wciskać strzykawkę, aby napełnić całą probówkę środkiem kontrastowym MR.
- Znieczulać zwierzęta za pomocą wentylacji z ~1 - 2% izofluranu zmieszanego z tlenem (2 l/min) podczas przygotowania i obrazowania. Potwierdź głębokość znieczulenia odruchem szczypania palców u stóp. Nałóż weterynaryjną maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Rozszerz żyłę ogonową za pomocą lampy grzewczej przed wkłuciem igły. Chwyć środek igły 30 G za pomocą kleszczy Kelly'ego i włóż ją do żyły ogonowej. Przyklej zarówno ogon, jak i rurkę do kawałka plastikowego lub kartonowego papieru (10 mm szerokości x 100 mm długości), aby ogon był prosty.
- Umieść zwierzę w pozycji leżącej na plecach w łóżku dla zwierząt wyposażonym w krążącą ciepłą wodę (lub ciepłe powietrze) w celu regulacji temperatury ciała podczas obrazowania. Ustaw temperaturę na łóżku na 37 °C. Włóż sondę temperatury doodbytniczą, aby monitorować temperaturę ciała podczas obrazowania.
- Nałóż prostopadło wygiętą plastikową deskę w okolicę brzucha. Upewnij się, że guz znajduje się za górnym końcem deski, a następnie lekko pociągnij deskę w dół (~ 2 mm), aby upewnić się, że guz zostanie złapany przez deskę. Mocno przyklej deskę do legowiska dla zwierząt.
- Przyklej przetwornik wkładki oddechowej (SA Instrument, Inc., Stony Brook, NY) do klatki piersiowej, aby monitorować oddychanie zwierząt podczas obrazowania. Umieść cewkę powierzchniową na górze obszaru guza i mocno przyklej ją do łóżka zwierzęcia. Wepchnij łóżko zwierzęcia do skanera MR, aby umieścić obszar guza w środku cewki objętościowej (średnica wewnętrzna: 72 mm).
- Wykonaj dopasowywanie i dostrajanie zarówno odbiornika, jak i nadajnika, a następnie podkładkowanie.
- Rozpocznij od anatomicznej sekwencji MR, aby zlokalizować guz. Użyj sekwencji turbo spin-echo zależnej od T2 (T2W), aby uzyskać obrazy osiowe o następujących parametrach akwizycji. Czas powtarzania (TR)/czas echa (TE) = 3,000/34 ms, matryca 128 x 128, pole widzenia 30 x 30 mm, liczba średnich = 1, długość ciągu echa = 4 i 20 sąsiadujących ze sobą plastrów o grubości 1 mm w trybie z przeplotem, aby pokryć cały obszar guza (całkowity czas skanowania: 1,6 min).
nuta: Ponieważ ortotopowe guzy trzustki są trudniejsze do zlokalizowania niż guzy podskórne, konwencjonalne obrazy lokalizacyjne o niższej rozdzielczości mogą nie być przydatne.
- Uzyskuj obrazy T1-weighted (T1W) z różnymi kątami obrotu, aby pobrać mapę T1. W tym celu należy zastosować podejście gradientowe z wielokątowym kątem odbicia z następującymi parametrami: czas powtarzania (TR)/czas echa (TE) = 115/3 ms, matryca 128 x 128, pole widzenia 30 x 30 mm, liczba średnich = 4, ~5 - 7 przylegających do siebie plastrów o grubości 1 mm w trybie z przeplotem w celu pokrycia obszaru guza, oraz siedem kątów odwrócenia 10, 20, 30, 40, 50, 60 i 70 (łączny czas skanowania pod kątem obrotu: 1 min).
nuta: Jednak podejście z wieloma kątami odwrócenia jest skuteczne tylko wtedy, gdy jednorodność pola B1 jest wysoka. Jeśli nie, mapy T1 można uzyskać za pomocą podejścia wielokrotnego TR.
- Zdobądź obrazy T1W przed i po wstrzyknięciu kontrastu MR na bazie gadolinu. Użyj tych samych parametrów akwizycji i geometrii do mapowania T1, ale ze stałym kątem odwrócenia wynoszącym 30. Użyj kodowania liniowego, aby zapewnić stan ustalony, gdy uzyskany jest środek przestrzeni k, zwłaszcza gdy używany jest krótki TR i kąt odwrócenia o niskim stopniu. Uzyskaj 5 obrazów bazowych przed wstrzyknięciem kontrastu. Następnie uzyskaj 40 obrazów po wstrzyknięciu kontrastu (całkowity czas skanowania: 45 min). Za pomocą pompki strzykawkowej wstrzykiwać środek kontrastowy ze stałą szybkością (0,01 ml/s).
- Monitoruj oddech zwierzęcia w sposób ciągły i dostosuj stężenie izofluranu, aby utrzymać częstość oddechów na poziomie 50 - 100 oddechów na minutę. Monitoruj temperaturę ciała zwierzęcia podczas obrazowania.
- Po wykonaniu DCE-MRI zdejmij igłę i inne sondy, a następnie umieść zwierzę w pustej klatce wyłożonej ręcznikami papierowymi. Delikatnie masuj dolną część brzucha. Klatkę należy umieścić do połowy pod lampą grzewczą, aby zwierzę mogło wchodzić i wychodzić z gradientu ciepła w miarę rekonwalescencji. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą w mostku.
