Test neuroplastyczności trzustki in vitro: badanie zmian w neuronach przewodu pokarmowego narażonych na zdrowe i nowotworowe ekstrakty z ludzkiej tkanki trzustki

Streszczenie

Źródło: Demir, I. E., et al. Symulacja neuroplastyczności trzustki: test plastyczności podwójnych neuronów in vitro. J. Vis. Exp. (2014).

Ten film demonstruje test neuroplastyczności in vitro w celu zbadania zmian morfologicznych w zwojach korzenia grzbietowego i neuronach splotu mięśniowo-rdzeniowego wystawionych na działanie zdrowych i rakowych ekstraktów z ludzkiej tkanki trzustkowej. Ten test pozwala nam zbadać przerost neurytów, wzór rozgałęzień i rozmiar neuronów.

Protokół

1. Izolacja neuronów

Gdy pobieranie ekstraktu/supernatantu zostanie zakończone, kontynuuj izolację neuronów.

1. W przypadku neuronów DRG należy pobrać DRG od szyjki macicy do odcinka lędźwiowego nowonarodzonych szczurów między dniem pourodzeniowym (P) 2-12 po dekapitacji i stereomikroskopowym rozwarstwieniu DRG (ryc. 1A). Aby mieć wystarczającą ilość neuronów DRG dla 24-dołkowej płytki, należy zebrać wszystkie DRG od szyjki macicy do odcinka lędźwiowego jednego nowonarodzonego szczura (co odpowiada 52 DRG) na płytkę.
2. Odetnij obwodowe (nerwowe) i centralne wypustki (korzenie) DRG za pomocą mikronożyczek. Pozostawienie wypustek na miejscu utrudnia rozcieranie i zwiększa ryzyko zanieczyszczenia hodowli przez fibroblasty.
3. W przypadku neuronów MP należy odciąć krezkę od jelita cienkiego i ręcznie i ostrożnie usunąć warstwę surowiczo-mięśniową jelita cienkiego (szczegółowy protokół izolacji MP, ryc. 1B). W przypadku MP należy pobrać splot od dwóch szczurów na płytkę 24-dołkową.
   nuta: Staraj się być tak delikatny, jak to możliwe, aby uniknąć rozdarć w warstwie surowiczo-mięśniowej, ponieważ utrudniają one jej pomyślne oddzielenie od jelita cienkiego.
4. Zebrać DRG i warstwę surowiczo-mięśniową w lodowatej pożywce MEM (minimal essential substance, MEM) dostarczanej z gentamycyną (20 mg w 500 ml pożywki) i metronidazolem (2,5 mg w 500 ml pożywki).
5. Po zebraniu DRG inkubuj je w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS) dostarczonym z kolagenazą typu II przez 20-30 minut. W celu izolacji MP inkubować w rodzaju kolagenazy od 1 do 3 godzin, w zależności od wieku zwierzęcia (ryc. 1C).
6. W przypadku MP zbierz przypominające siatkę kawałki MP pod mikroskopem stereoskopowym i przenieś do lodowatego MEM.
7. Następnie rozprowadzić DRG i MP przez strzykawki o zmniejszającej się średnicy.
   nuta: Nadmierne roztarcie może zniszczyć neurony, ale mniej komórki glejowe.
8. Gdy pożywka zawierająca DRG lub MP stanie się mętna, odwirować zawiesinę o stężeniu 93,9 x g przez 5 minut, wyrzucić pożywkę i ponownie zawiesić w pożywce Neurobaseal (uzupełnionej 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 0,5 mM L-glutaminy i 2% B-27).
9. Policz całkowitą liczbę komórek (tj. neuronów ORAZ gleju) za pomocą hemocytometru.
   nuta: Liczba potrzebnych komórek zależy od parametru pomiaru. Do ilościowego określenia gęstości neurytów potrzebne są gęstsze hodowle, a tym samym większa liczba komórek niż do pomiaru wzrostu neurytów, wielkości okołokarionalnej i wzoru rozgałęzień poszczególnych neuronów. Do pomiarów gęstości neurytów użyj np. 10 000 komórek (neuron + glej) / studzienka lub 1 500 neuronów / studnia. Do morfometrii pojedynczych neuronów zaleca się krótką (1-minutową) trypsynizację komórek i wysiew 2500 komórek/studnię lub 400 neuronów/studnię. Typowa wydajność komórek uzyskanych od jednego szczura wynosi około 300 000-500 000 komórek.
10. Wysiewaj komórki na 13-milimetrowych szkiełkach nakrywkowych, które zostały pokryte poprzedniej nocy i przykryj dołki pożywką Neurobaseal (uzupełnioną 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 0,5 mM L-glutaminy i 2% B-27) (Figura 1D).
    nuta: Stosować szkiełka nakrywkowe pokryte poli-D-lizyną (40 mg/^m2) LUB ornityną i lamininą (1 mg/ml każde). Komórki przyłączają się do poli-D-lizyny niezwykle szybko, dzięki czemu nadaje się ona do eksperymentów, w których potrzebnych jest wiele komórek (np. pomiary gęstości neurytów). Przywiązanie do lamininy jest na ogół nieco słabsze, ale laminina jest silnym promotorem wzrostu neurytów. Dlatego do pomiarów rozgałęzień neuronalnych i długości neurytów preferowane jest powlekanie ornityną/lamininą.
11. Pozwól komórkom przyczepić się do studzienek na noc. Następnego dnia przygotować pożywkę uzupełnioną ekstraktem (przy końcowym stężeniu ekstraktu/supernatantu 100 μg/ml).
12. Odessać podłoże wysiewające i wykonać opcjonalne, bardzo delikatne płukanie PBS, a następnie powoli pipetować pożywkę z ekstraktem/supernatantem (rysunek 1E).
13. Pozwól komórkom rosnąć przez 48 godzin. Odessać pożywkę i utrwalić w 4% paraformaldehydu w celu barwienia immunologicznego (ryc. 1F).
14. Wykonaj podwójne barwienie immunofluorescencyjne przy użyciu markerów specyficznych dla neuronów (np. tubulina beta III) i specyficznych dla gleju (np. kwaśne białko fibrylarne gleju / GFAP) (Figura 1G).
15. Do morfometrii należy użyć mikroskopu światła odwróconego wyposażonego w kamerę CCD w połączeniu ze zautomatyzowanym oprogramowaniem, które umożliwia pomiar gęstości neurytów (patrz tabela).
16. Gęstość neurytów w kulturach neuronalnych mierzy się na 4-5 reprezentatywnych mikrofotografiach w 200-krotnym powiększeniu z 4 różnych regionów o najgęstszym wzroście na każdym szkiełku nakrywkowym, nakładając siatkę 50 μm x 50 μm i zliczając gęstość włókien na kwadrat mierzoną w przecinających się włóknach. Przerost neurytów, średnia liczba gałęzi na neuron, średnia długość gałęzi i rozmiar okołokarionalny można zmierzyć z losowo wybranych 30 pojedynczych neuronów z każdego szkiełka nakrywkowego, oznaczając neuryty i perikarya (ryc. 1H).

Wyniki

Rysunek 1. Schematyczny protokół testu neuroplastyczności in vitro. Niniejszy test wykorzystuje neurony zwojów korzenia grzbietowego nowonarodzonego szczura (DRG) i neuronów splotu mięśniowo-jelitowego (MP) do zbadania wpływu ekstraktów z tkanki trzustki lub supernatantów komórkowych na morfologię neuronów i gleju. DRG pobiera się po laminektomii przedniej oraz warstwie su...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bromowodorek poli-D-lizyny	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P1149
Ornityna/laminina	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P2533/L4544
Szkiełka nakrywkowe 13 mm	Merck		Do stosowania na płytce 24-dołkowej
Membranator S	Sartorius Sartorius (Wyspa
Przeciwciało anty-Beta-III-tubuliny	Milipory	MAB1637	Koncentracja 1:200
Przeciwciało anty-GFAP	DAKO	Zobacz materiał M0761	Koncentracja 1:400
Bufor RIPA + inhibitor proteazy			Każdy dostawca
Podłoże nerwowo-podstawowe	Gibco/Nauki przyrodnicze	21103-049
Suplement B-27	Gibco/Nauki przyrodnicze	17504044	Wiadomo, że jakość B-27 zależy od numeru partii
gentamycyna/metronidazo			Każdy dostawca
Minimalna ilość niezbędnego podłoża	Gibco/Nauki przyrodnicze	31095-029
Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)	Gibco/Nauki przyrodnicze	24020133	Poprawia aktywność kolagenazy, gdy zawiera Ca/Mg
Kolagenaza typu II	Biochemiczny Worthington	Certyfikat CLS-2	Zdobądź partie o aktywności co najmniej 200 U/mg
Trypsyna-EDTA 0,25%	Gibco/Nauki przyrodnicze	25200056
4% paraformaldehydu			Każdy dostawca
Oprogramowanie dokumentacyjne AnalySIS	Olympus

Sar TGL