Test fosfatazy w komórkach CRC: metoda badania stanu fosforylacji białka Tau w komórkach raka jelita grubego

Streszczenie

Źródło: Huda, M. N., et al. Test fosforylacji i wiązania mikrotubul wraz z lokalizacją białka Tau w komórkach raka jelita grubego. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film opisuje protokół oceny stanu fosforylacji białka tau za pomocą testu fosfatazy w komórkach raka jelita grubego. Enzym fosfataza działa na grupy fosforanowe obecne na białku tau, zwiększając ruchliwość białka tau w żelu SDS PAGE w porównaniu z nietraktowanymi próbkami białka tau.

Protokół

1. Test fosfatazy

1. Traktuj lizaty komórkowe, gdy komórki osiągną ~ 65% konfluencji (przybliżonej za pomocą mikroskopii), usuń pożywkę uzupełnioną MEM i dodaj MEM bez surowicy z kurkuminą 5 μM, 10 μM i 30 μM lub 25 mM, 50 mM i 100 mM LiCl. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO₂ po 24 godzinach od poddania działaniu substancji, przemyć komórki 1 ml lodowato zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i zeskrobać komórki za pomocą skrobaka do komórek. Zeskrobane komórki przenieść do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i wirować przez 4 minuty w temperaturze 1 800 x g w temperaturze 4 °C w celu uzyskania granulek komórek. Poddać ogniwa lizie, zawieszając granulki w 100 μl kompletnego bufora RIPA w temperaturze 4 °C na 20 minut, regularnie stukając w probówki. Krótko poddać próbki działaniu sonikacji. Odwirować homogenaty komórkowe w wirówce stołowej o sile 22 570 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatanty do innych znakowanych probówek za pomocą pipety) z fosfatazą alkaliczną w buforze fosfatazy alkalicznej.
   1. Zarówno w przypadku próbek kontrolnych, jak i poddanych działaniu substancji należy przygotować 20 μl próbek zawierających 20 μg białka całkowitego. Dodać objętość lizatów komórkowych zawierających 20 μg białka ogółem, a następnie 2 μl buforu fosfatazy alkalicznej i 10 μl fosfatazy alkalicznej. Dodać wodę destylowaną do 20 μl.
2. Inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Zatrzymać reakcję przez dodanie kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) o końcowym stężeniu 50 mM lub przez dodanie ortowanadanu sodu (Na₃VO₄) o końcowym stężeniu 10 mM. Reakcję można również zatrzymać przez ogrzewanie w temperaturze 75 °C przez 5 minut.
3. Przed zakończeniem inkubacji próbek z fosfatazą należy przygotować próbki o tym samym stężeniu bez dodawania fosfatazy w celu porównania z próbkami poddanymi działaniu fosfatazy.
4. Dodaj świeżo przygotowany bufor 4X SDS do ładowania żelu zawierający 400 mM naziemnej telewizji cyfrowej.
5. Inkubować próbki w bloku grzewczym w temperaturze 100 °C przez 5 minut. Wymieszać próbki za pomocą wiru. Schłodzić w temperaturze pokojowej przez ~10-15 min.
6. Zmontuj system elektroforezy do uruchamiania 10% żelu poliakryloamidowego firmy SDS-PAGE.
   1. Załaduj 10 μg białka (13 μl próbki) na studzienkę na 10% żel poliakrylamidowy. Załaduj drabinę o masie cząsteczkowej.
   2. Po załadowaniu próbki podłącz elektrody dodatnie i ujemne systemu elektroforezy do źródła zasilania, aby utrzymać stałe napięcie. Początkowo należy rozpocząć od napięcia 70 V przez 20 minut, aby przenieść próbki białka z żelu do układania w stos do żelu rozdzielczego. Następnie zwiększ napięcie do 125 V i uruchom żel na około 70-120 minut, aż próbki i drabinka białkowa dotrą do końca żelu.
   3. Po zakończeniu elektroforezy należy przenieść żel na membranę PVDF za pomocą mokrego systemu do elektrobibuły. Przesył przez ~100 min przy 100 V.
   4. Zaznacz plamę, wykonując małe nacięcie z boku drabiny o masie cząsteczkowej. Do przecięcia kleksa użyj przezroczystego plastikowego arkusza i ostrego noża.
7. Zablokuj membranę w 4% buforze blokującym BSA na 90 minut w temperaturze pokojowej.
8. Inkubować blot w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego (anty-tau w stosunku 1:5 000) w temperaturze 4 °C przez noc. Umyj blot w PBST cztery razy, po 7 minut każdy.
9. Przygotować odpowiedni roztwór przeciwciała drugorzędowego (kozia anty-mysia IgG w stosunku 1:5 000) i inkubować blot przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Umyj w PBST cztery razy, po 7 minut każdy.
10. Opracuj blot za pomocą zestawu do chemiluminescencji zgodnie z zaleceniami producenta. Przykryj blot przezroczystą folią. Pozyskiwanie obrazów za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencji dla chemiluminescencji za pomocą odpowiedniego oprogramowania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Komórka HCT 116	Kontroler ATCC (Kontroler T	Zobacz materiał CCL-247
Talerz 100 mm	Corning	430161
MEM (EBSS)	Klon	SH30024.01
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	ThermoFisher (Gibco)	16000044	Przechowywać w temperaturze -20 °C
Przeciwciało anty-Tau 13	Księga Abcam	AB19030
Ditiotreitol (DTT)	Roche	10 708 984 001	Temperatura przechowywania 2–8 °C
Kurkumina	Sigma-Aldrich (Fluka)	Numer telefonu 78246	Temperatura przechowywania 2–8 °C
Przeciwciało anty-Tau (fosfo S396)	Biblioteka ABCAM	ab109390
FastAP Termoczuła fosfataza alkaliczna	Thermo Scientific	EF0651	Przechowywać w temperaturze -20 °C
PMSF (Kanał PMSF)	Sigma	Zobacz materiał P7626	Przechowywać w temperaturze pokojowej
Koktajl inhibitorów fosfatazy	Sygnalizacja komórkowa	Numer katalogowy: 5870	Przechowywać w temperaturze 4 °C
Koktajl inhibitorów proteazy	Sygnalizacja komórkowa	Numer katalogowy: 5871	Przechowywać w temperaturze 4 °C
Kozie przeciwciało anty-mysie IgG Drugorzędowe	Rybak termiczny	A-11005	Przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	Affymetrix	Numer telefonu 75819
Obrazowanie molekularne	Bio-Rad	ChemiDoc XRS+	Przechowywać w temperaturze 4 °C
Bufor RIPA	Sigma	R 0278	Temperatura przechowywania 2–8 °C
Tryton X-100	Sigma-Aldrich	X - 100	Przechowywać w temperaturze około 25 °C
Membrana PVDF	Bio-Rad	Numer katalogowy: 162-0177
Kozie przeciwciało anty-mysie IgG Drugorzędowe	Rybak termiczny	A-11005	Przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	Affymetrix	Numer telefonu 75819
Odczynnik do oznaczania białek	Bio-Rad	500-0006
Dysmubrator dźwiękowy	Fisher Naukowy	Wzór 500
Wirówki mikrolitrowe	Hettich Zentrifugen	MIKRO 200 R