Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Zwierzęta doświadczalne, odczynniki i sprzęt
- Użyj myszy dopasowanych do wieku i płci. Rozpocznij badanie w wieku 7-9 tygodni, ponieważ skóra u większości myszy jest w telogenie (faza spoczynku) w tym wieku.
- Obserwuj zachowanie zwierząt podczas badania i jeśli walczą, co często zdarza się w przypadku samców, trzymaj je osobno. Walki mogą powodować skaleczenia skóry, które sprzyjają powstawaniu guza. Samice myszy są preferowane ze względu na ich mniej agresywne zachowanie. Typowa wielkość grupy doświadczalnej waha się między 8 a 20 zwierzętami w grupie.
nuta: Obliczenia mocy oparte na wariancji biologicznej zaobserwowanej we wcześniejszych badaniach pomagają wybrać wystarczająco dużą wielkość grupy. Szczepy użyte jako przykłady w tym artykule to Balb/c i C57BL/6. Jednak wiele innych szczepów myszy, takich jak SENCAR i FVB, było używanych z modelem DMBA-TPA oraz szczurami Wistar i Sprague-Dawley. Przed rozpoczęciem badania potrzebna jest licencja od krajowej lub lokalnej komisji ds. pracy ze zwierzętami. Oprócz ogólnych względów dotyczących dobrostanu, punktami końcowymi specyficznymi dla modelu są zazwyczaj rak płaskonabłonkowy (SCC) i zakażenie skóry. Zadrapania na skórze spowodowane swędzeniem po zastosowaniu rakotwórczych chemikaliów w acetonie są typowe, ale poza tym zwierzęta nie powinny wykazywać żadnych oznak dyskomfortu. Regularne ważenie (np. 2 razy w miesiącu) pomaga ocenić dobrostan zwierząt.
- Użyj DMBA i TPA, oba rozcieńczone w acetonie. Stężenie robocze DMBA wynosi 250 g/L. Dawka dla jednego zwierzęcia to 50 μg DMBA w 200 μL acetonu. Stężenie podstawowe TPA wynosi 125 g/l, a stężenie po zabiegu 25 g/l. Dawka TPA dla jednego zwierzęcia wynosi 5 μg w 200 μl acetonu.
UWAGA: DMBA jest szkodliwy w przypadku połknięcia i może powodować raka. Aceton szybko odparowuje i jest łatwopalny. Może powodować zawroty głowy i podrażniać oczy. Używaj maski oddechowej i/lub pracuj pod przepływem podciśnienia. Zmień rękawice po kontakcie z którąkolwiek z tych substancji chemicznych. Indywidualnie wentylowane klatki zapobiegają rozprzestrzenianiu się chemikaliów podczas trzymania myszy. Po aplikacji należy zebrać końcówki pipet używane do obchodzenia się z DMBA i wyrzucić je jako odpady niebezpieczne.
nuta: DMBA musi być chroniony przed światłem. Rozcieńczony TPA jest przechowywany w temperaturze -20 °C, najlepiej chroniony przed światłem.
- Zaopatrz się w następujący sprzęt: wagę, zwykłą maszynkę do golenia sierści, pipety i końcówki o odpowiednim rozmiarze, zwykłą linijkę, aparat cyfrowy, notatnik oraz długopis lub komputer do rejestrowania brodawczaków, system do znieczulenia wziewnego lub ogranicznik myszy z otworem z tyłu oraz system narkozy dwutlenkiem węgla do składania ofiar z myszy.
2. Indukcja i promocja brodawczaka skórnego
- Ogol skórę grzbietu i zważ zwierzę. Później należy ogolić skórę zawsze, gdy jest to potrzebne, ale nie w momencie ekspozycji na chemikalia.
nuta: Zachowaj ostrożność podczas golenia wokół brodawczaków i unikaj wykonywania nacięć na skórze. Waż każde zwierzę co 2 tygodnie, aby zauważyć potencjalną utratę wagi.
- Nanieś 50 μg DMBA w 200 μl acetonu miejscowo na ogolony obszar za pomocą pipety 48 godzin po zgoleniu sierści. W razie potrzeby unieruchomić zwierzę za pomocą lekkiego znieczulenia wziewnego lub przytrzymywania myszy.
- Po 7 dniach należy podać pierwszą dawkę TPA. Nakładać miejscowo 5 μg TPA w 200 μl acetonu pipetą 2x w tygodniu, najlepiej w poniedziałek i czwartek lub wtorek i piątek.
- Licz, rejestruj i fotografuj brodawczaki co tydzień. Wyczuwalna masa o średnicy większej niż 1 mm jest uważana za brodawczaka, jeśli utrzymuje się dłużej niż 1 tydzień. Zaznacz każdego brodawczaka na mapie i co tydzień wymieniaj jego rozmiar - przechowuj zdjęcia cyfrowe.
