Kierowana różnicowanie hESC w konkretne komórki wzbudziło duże zainteresowanie w medycynie regeneracyjnej. Przedstawiamy zwięzły, szczegółowy protokół służący do określania losów wybranych hESC in vivo, który stanowi cenne narzędzie do charakteryzacji reagentów specyficznych dla tkanek w terapiach komórkowych.
Artykuł metodologiczny
Mapowanie losów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych poprzez tworzenie potworniaków
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESCs) posiadają nieograniczoną zdolność do samoodnawiania się oraz zdolność do różnicowania się w komórki pochodzące ze wszystkich trzech embrionalnych listków zarodkowych (1). Kierowana dyferencjacja hESCs w konkretne typy komórek wzbudziła duże zainteresowanie w dziedzinie medycyny regeneracyjnej (np. (2-5)), a metody określaniain vivolos wybranych lub zmodyfikowanych hESC jest kluczowy dla tego przedsięwzięcia. W tym celu zaadaptowaliśmy wysoce wydajny test tworzenia potworniaków. Niewielka liczba specyficznie wybranych hESC jest mieszana z nieróżnicowanymi hESC typu dzikiego oraz lektyną z Phaseolus vulgaris w celu utworzenia pelletu komórkowego. Następnie zostaje on przeszczepiony pod torebkę nerki u myszy z niedoborem odporności. Już 2,5 x 105Do utworzenia 16 cm potrzebne są hESC3teratoma w ciągu 8-12 tygodni. Los pierwotnie wybranych hESC można następnie określić za pomocą immunohistochemii. Metoda ta stanowi wartościowe narzędzie do charakteryzacji reagentów specyficznych dla tkanek w terapii komórkowej.
Protokół
Poniższy protokół pisemny opiera się na opublikowanych parametrach podanych przez autorów, z pewnymi modyfikacjami. Protokół jest przeprowadzany za zgodą Komitetów ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC) oraz Nadzoru nad Badaniami nad Komórkami Macierzystymi (SCRO) UCSF.
I. Hodowla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESCs)
- Hodować hESC w standardowych płytkach 6-dołkowych (dołki o średnicy 3,5 cm).
- Przynajmniej 12 godzin przed pasażowaniem komórek, wysiać komórki karmne z embrionalnych fibroblastów myszy (MEF; uzyskane z myszy CF1 w dniu e12,5 z zapłodnienia, napromieniowane dawką 10 Ci) na płytki powlekone 1% żelatyną (6,7). Komórki MEF należy wysiać do uzyskania 50–60% konfluencji lub w zagęszczeniu 4 x 105 liczba komórek na studzienkę o średnicy 3,5 cm (Rysunek 1).
- Przesiądź komórki, gdy kolonie osiągną ok. 70% konfluencji (Rysunek 2).
- Aby przeprowadzić pasażowanie komórek, należy odessać pożywkę wzrostową KSR (6) z dołków i zastąpić ją 0,5 ml pożywki zawierającej kolagenazę IV w KSR w stężeniu 1 mg/ml.
- Inkubować płytki z kolagenazą IV w temperaturze 37°C/5% CO2 przez 5 minut lub do momentu, gdy brzegi kolonii zaczną odrywać się od płytki.
- Usunąć kolagenazę IV z płytki, dodać 0,5 ml KSR do każdej dołki i ręcznie zeskrobować komórki, aby całkowicie usunąć je z płytki.
- Należy zebrać zawiesinę komórkową z każdej studzienki, umieścić ją w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i pozostawić komórki do osiadania pod wpływem grawitacji przez 5 minut.
- Odlej supernatant z probówki, pozostawiając komórki i medium w całkowitej objętości ok.300μl.
- Używając 200 μl ustawić mikropipetę na maksymalną objętość, a następnie delikatnie pipetować zawiesinę komórkową 5–6 razy, aby rozbić kolonie.
- Dopełnić objętość zawiesiny komórkowej do całkowitej objętości 9 ml na każdą pierwotną studzienkę z komórkami, używając medium KSR (tj.(jeśli pobierana jest zawartość jednej studzienki, probówka powinna zawierać 9 ml). Uzupełnić pożywkę rekombinowanym ludzkim podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF) do stężenia 12,5 ng/ml.
- Po przemyciu nowych studzienek zawierających komórki MEF (patrz krok 2) solą fizjologiczną z buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS) w celu usunięcia całego serum, należy dodać 3 ml zawiesiny komórkowej do każdej studzienki i inkubować płytki w 37°C/5% CO2.
- Wymień medium KSR z bFGF 24 godziny po pasażowaniu oraz co 24–48 godzin, aż komórki będą gotowe do ponownego pasażowania.
II. Przygotowanie pelletu hESC do przeszczepienia
- Na 24 godziny przed przeszczepem dodać inhibitor ROCK do medium KSR do stężenia końcowego 10μM, aby zwiększyć żywotność komórek (8). Jedna studnia z komórkami o konfluencji ~70% (5 x 105 komórek) pozwoli na stworzenie dwóch pelletów, przy czym do każdej torebki nerki należy wprowadzić dwa pellety.
- Aby przygotować pellety komórkowe do przeszczepu (9), inkubować kultury traktowane inhibitorem ROCK z kolagenazą IV przez 5 minut w temperaturze 37°C/5%CO2.
- Odssać kolagenazę IV ze studni i zastąpić ją 1 ml DPBS z 10% penicyliną/streptomycyną (pen/strep).
- Ręcznie zebrać kolonie z płytki, przepłukać studnię dodatkowymi 1 ml DPBS z pen/strep i przenieść każdą 1 ml alikwotę zawiesiny komórkowej do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
- Krótko wirować probówki przy 8,0 x g, odessać nadsącz i resuspender pellety w 50μl DPBS z pen/strep.
- Aby wspomóc agregację komórek przed transplantacją, dodać do każdej probówki 10μl lecytyny z Phaseolus vulgaris (PHA) w stężeniu 1 mg/ml w DPBS.
- Inkubować zawiesinę komórek/PHA w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie wirować przez 2 minuty przy 8,0 x g. Obrócić probówki o 180° w gniazdach rotora i wirować ponownie przez 2 minuty przy 8,0 x g.
- Ostrożnie odessać nadsącz, pozostawiając pellet nienaruszony.
- Odczepić pellety komórkowe z probówek, delikatnie pipetując 20μl KSR przy krawędzi pelletu, aż powoli uniesie się on z dna.
- Po odczepieniu natychmiast przenieść pellety na wkładki MILLICELL 0,4μm umieszczone w studniach o średnicy 3,5 cm zawierających 3 ml KSR i inkubować od 2 godzin do nocy w temperaturze 37°C/5%CO2.
III. Przeszczep torebki nerkowej
- Wszystkie procedury z udziałem zwierząt należy przeprowadzać zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi, stosując odpowiednią technikę aseptyczną.
- Myszy SCID beige (CB17.Cg-PrkdcscidLyst bg/Crl) w wieku 8-12 tygodni znieczulić, stosując kombinację wziewnego 3% izofluranu/0,5% O2 oraz dożylne podanie trybromoetanolu (Avertin; 25 mg/kg, świeżo przygotowany). Dwa pelety komórkowe na mysz zostaną wszczepione zgodnie z opisanymi technikami (10).
- Po umieszczeniu myszy na podkładce grzewczej w celu zapobiegania hipotermii, należy ogolić obszar nacięcia, a następnie zdezynfekować go chloreksydyną. Wykonać nacięcie skóry o długości 2,5 cm, lekko przesunięte znad centrum, ale równoległe do kręgosłupa.
- Utrzymując obszar nacięcia w wilgotności za pomocą sterylnej soli fizjologicznej, wykonać mniejsze nacięcie przez mięsień, tuż poniżej żeber i około 1 cm od kręgosłupa. Nacięcie powinno być na tyle duże, aby można było wyciągnąć nerkę, ale na tyle małe, aby nerka nie cofła się do jamy brzusznej bez użycia siły.
- Ostrożnie wyciągnąć nerkę przez nacięcie w mięśniu, używając szklanej pipety Pasteura, której końcówkę wyciągnięto tak, aby uzyskać kształt tępego, lekko zakrzywionego haczyka.
- Zwilżyć nerkę sterylnym DPBS, aby zapobiec wysychaniu torebki. Może być konieczne powtarzanie tej czynności w trakcie całej procedury, ponieważ torebka jest bardzo delikatna.
- Używając pęsety Dumont #5, delikatnie unieść torebkę z nerki i wykonać nacięcie o długości 2 mm za pomocą sprężynowych nożyczek Vannasa.
- Za pomocą drugiej szklanej pipety, której końcówkę wyciągnięto do formy bardzo cienkiej, tępej sondy, stworzyć małą kieszonkę między torebką a nerką.
- Używając końcówki pipety o dużym otworze umieszczonej na jednorazowej pipecie transferowej, pobrać pojedynczy pelet komórkowy z insertu MILLICELL. Należy upewnić się, że pobrano jak najmniej dodatkowego medium, ponieważ nadmiar medium może utrudnić transfer peletu.
- Podtrzymując krawędź nacięcia w celu utworzenia kieszonki, delikatnie umieścić pelet obok otworu i wsunąć go do kieszonki w kierunku jednego z biegunów nerki za pomocą wyciągniętej pipety.
- Powtórzyć proces z drugim peletem. Umieścić go pod torebką tej samej nerki, ale w kierunku przeciwległego bieguna.
- Ostrożnie nałożyć torebkę z powrotem na pelety. Pelety powinny pozostać wewnątrz kieszonki; zamknięcie torebki nie wymaga szwów.
- Delikatnie wsunąć nerkę z powrotem do jamy brzusznej i zamknąć ścianę mięśniową za pomocą szwów jedwabnych 4-0 (lub mniejszych) z dołączoną igłą tnącą w odwrotnym kierunku. Nacięcie powinno być na tyle małe, aby wystarczył pojedynczy szew.
- Zamknąć skórę za pomocą serii 4-5 szwów przerywanych, używając tego samego materiału szewnego.
- Przed umieszczeniem myszy z powrotem w klatce, podać 0,05 mg/kg buprenorfiny (11,12) oraz 5 mg/kg ketoprofenu (12,13) odpowiednio jako krótko- i długoterminowe środki przeciwbólowe. Substancje kontrolowane powinny być stosowane wyłącznie zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
- Przenieść zwierzę z powrotem do klatki i pozwolić mu dojść do siebie po znieczuleniu na podkładce grzewczej. Powinno to potrwać około 20-30 minut.
- Gdy mysz odzyska pełną sprawność ruchową, może zostać zwrócona do pomieszczenia dla zwierząt.
IV. Pobieranie, utrwalanie i krojenie potworniaka
- W 8-12 tygodniu po operacji w pobliżu nerki powinien być wyczuwalny niewielki potworniak. Często rozwijają się również duże, wypełnione płynem cysty, zaczynając od 6-8 tygodnia. Mogą one wymagać wcześniejszego pobrania tkanek, jeśli powodują dyskomfort u zwierzęcia. Ponieważ jednak potworniaki rosną wolniej niż cysty, należy czekać jak najdłużej, aby uzyskać potworniaka o rozmiarze wystarczającym do analizy (t.j. co najmniej 8 tygodni).
- Usunąć nerkę, potworniaka oraz wszelkie otaczające cysty jako blok tkanki z jamy brzusznej, stosując tę samą metodę chirurgiczną, którą uzyskano pierwotny dostęp do nerki (patrz Sekcja III, kroki 1-4 powyżej).
- Umieścić cały blok wyciętej tkanki w probówce zawierającej 10% buforowaną formalinę.
- Pozostawić potworniaka do utrwalenia przez noc w temperaturze 4°C.
- Następnego dnia wyjąć potworniaka z probówki. Odciąć wszelkie cysty oraz jak największą część nerki, uważając, aby nie uszkodzić samego potworniaka (Rycina 3). Większe potworniaki można przekroić na pół, aby ułatwić preparatykę i zatopienie w parafinie.
- Przygotować potworniaka, stosując standardową technikę utrwalania w parafinie. Dostępne są urządzenia automatyczne (np. Shandon Hypercenter):
I. 80% Flex alcohol 2 godziny II. 80% Flex alcohol 1 godzina III. 85% Flex alcohol 1,5 godziny IV. 95% Flex alcohol 1 godzina V. 10% Flex alcohol 1 godzina VI. 10% Flex alcohol 1 godzina VII. 10% Flex alcohol 1 godzina VIII. Clear-Rite 3 1 godzina IX. Clear-Rite 3 1 godzina X. Clear-Rite 3 1 godzina XI. Parafina (TissuePrep) 2 godziny XII. Parafina (TissuePrep) 2 godziny
V. Immunohistochemia i analiza
- Po zatopieniu w parafinie należy wykonać skrawki teratoma w 5μm wykonanie seryjnych skrawków przy użyciu mikrotomu rotacyjnego i przeniesienie ich z kąpieli wodnej na szkiełka.
- Przed barwieniem wygrzewaj preparaty na szkiełkach przez co najmniej jedną godzinę.
- Zabarwić preparaty hematoksyliną i eozyną metodami standardowymi, aby zidentyfikować struktury tkankowe reprezentatywne dla każdej z trzech embrionalnych warstw zarodkowych (Rysunek 4):
I. Przemywanie ksylenem 3–5 minut II. Ksylen 3–5 minut III. 10% alkohol 3–5 minut IV. alkohol 10% 3–5 minut V. alkohol 95% 3–5 minut VI. 80% alkohol 3–5 minut VII. Płukanie wodą (kilkakrotna wymiana) 2 minuty VIII. Hematoksylina Gilla nr 3 2–5 minut IX. Przemywanie wodą (kilkukrotne) do momentu, aż woda stanie się przejrzysta X. Woda Scotta (do niebieskich jąder) 3 minuty lub więcej XI. Płukanie wodą (kilka razy) 1-2 minuty XII. Eozyna Y 1 minuta XIII. Płukanie wodą (kilkukrotna wymiana) 30 sekundów XIV. 80% alkohol 1 minuta XV. alkohol 95% 2 minuty XVI. alkohol 95% 2 minuty XVII. 10% alkohol 3 minuty XVIII. 10% alkohol (czysty) 3 minuty XIX. Ksylen 2 minuty lub więcej XX. Ksylen 2 minuty lub więcej - Przymocuj szkiełko nakrywkowe do każdego preparatu za pomocą medium Permount.
VI. Reprezentatywne wyniki
Rycina 1. Wysiew napromieniowanych embrionalnych fibroblastów myszy szczepu CF1 jako warstwy pożywkowej do hodowli niezróżnicowanych hESC. MEF wysiewa się do osiągnięcia konfluencji na poziomie ~50%, jak pokazano tutaj, lub w zagęszczeniu 4 x 105 komórek na studzienkę o średnicy 3,5 cm w 6-studzienkowej płytce hodowlanej. Pasek, 100 μm.
Rysunek 2. Przykład subkonfluentnej hodowli niezróżnicowanych hESC na warstwie wspierającej MEF. hESC hoduje się na warstwach pożywkowych MEF do uzyskania konfluencji na poziomie ok. 70%, jak pokazano tutaj, a następnie pasażuje zgodnie z opisem. Pasek skali, 100 μm.
Rysunek 3. Przykład wyeksplantowanych potworniaków. Po wycieniu potworniak, nerka oraz wszelkie tkanki dodatkowe zostają utrwalone w formalinie jako jeden blok, a następnie nerka i tkanki dodatkowe są ostrożnie usuwane przed zatopieniem w parafinie.
Rysunek 4. Potworniaki pochodne z niezróżnicowanych hESC zawierają tkanki reprezentujące wszystkie trzy listki zarodkowe in vivo. Potworniak, taki jak przedstawiony w Rysunek 3podano do sekcji i zabarwiono hematoksyliną i eozyną w celu identyfikacji tkanek embrionalnych. hESC dają początek tkankom pochodzącym ze wszystkich trzech embrionalnych listków zarodkowych (ektodermy (A,B), mezodermy (C), endodermy (D). (A) Początkowa struktura cewy nerwowej. (B) Pierwotny nabłonek płaski. (C) Chrząstka otoczona torebką z zagęszczonego mezenchymy. (D) Gruczołowata struktura jelita. Pasek, 100 μmObrazy przedrukowane za zgodą autora.
Rysunek 5. Analiza potworniaka może być wykorzystana do mapowania losów znakowanych, niezróżnicowanych hESC. Zgodnie z wcześniejszą publikacją (9), do mapowania losów komórek znakowanych w teście tworzenia potworniaków można wykorzystać mieszaninę specyficznie znakowanych hESC oraz nieznakowanych hESC. Jak pokazano tutaj, niediferencjonowane hESC wykazujące marker powierzchniowy CD13 i znakowane wzmocnionym zielonym białkiem fluorescencyjnym (eGFP) zmieszano z nieznakowanymi, niediferencjonowanymi hESC. Wykorzystano je do wytworzenia potworniaków poprzez przeszczepienie do torebki nerki. Analiza immunohistochemiczna przekrojów potworniaków barwionych hematoksyliną i eozyną z użyciem przeciwciała anty-eGFP wykazuje neuroektodermalny los hESC CD13+. Potworniaki przetworzono zgodnie z opisem w Rycina 4 i poddano przeciwbarwieniu przeciwciałem anty-eGFP (brązowy) w celu lokalizacji pochodnych komórek CD13+GFP+ w obrębie tkanek. Komórki pochodne od CD13+ (strzałki) zaobserwowano w tkankach pochodzących z ektodermy zarodkowej, a konkretnie z nabłonka neuronowego (lewy) oraz powstające struktury przypominające rurkę neuralną (prawidłowy). Pasek, 100 μmRyciny przedrukowane za zgodą autora.
Żelatyna
- 0,1% żelatyna wieprzowa
- 9,9% DPBS
- Dodać żelatynę do DPBS, inkubować w temperaturze 37°C przez jedną godzinę lub do czasu całkowitego rozpuszczenia żelatyny, a następnie poddać sterylizacji przez filtrowanie (0,2μm) przed użyciem.
Pożywka dla MEF
- 10% płodowej surowicy bydlęcej (Qualified)
- 90% modyfikowanej przez Dulbecco podstawowej pożywki DMEM (D-MEM)
- 1x L-glutamina
- 1x pen/strep
- Sterylizować przez filtrowanie przed użyciem.
Pożywka KSR (Knockout Serum Replacement)
- 20% zamiennika surowicy KnockOut Serum Replacement
- 80% KnockOut D-MEM
- 1x L-glutaminy
- 1x nieistotnych aminokwasów (Nonessential Amino Acids)
- 0,1 mM β-merkaptoetanolu/
- 12,5 ng/ml bFGF
- Sterylizować przez filtrowanie.
- Przechowywać w temperaturze 4°C, ale ogrzać do 37°C przed dodaniem do komórek.
- bFGF dodawać bezpośrednio przed użyciem.
Kolagenaza IV
- Rozpuścić 1 mg/ml w medium KSR, inkubując w temperaturze 37°C przez 1-2 godziny lub do czasu całkowitego rozpuszczenia proszku.
- Sterylizować poprzez filtrację.
Avertin
- 0,25 g 2,2,2-tribromoetanolu
- 0,25 ml 2-metylo-2-butanolu
- Inkubować w temperaturze 37°C przez noc w celu przygotowania 10% roztworu.
- Na kilka godzin przed operacją rozcieńczyć do 2,5% roztworu roboczego za pomocą DPBS i inkubować w temperaturze 37°C przez co najmniej 1 godzinę.
- Sterylizować przez filtrowanie i podzielić na alykwoanty.
- Tribromoetanol jest bardzo światłoczuły, dlatego należy chronić go przed światłem na wszystkich etapach przygotowania i stosowania.
- Przygotować nie wcześniej niż 12-24 godziny przed użyciem.
Buprenorfina
- roztwór zapasowy 1 mg/ml w metanolu
- Rozcieńczyć do roztworu roboczego o stężeniu 0,015 mg/ml, używając sterylnej H2O.
- Przechowywać w temperaturze -20°C przez maksymalnie 1 miesiąc.
Ketoprofen
- roztwór roboczy 0,5 mg/ml w DPBS
- Dodać DPBS, inkubować przez noc w 37°C przez 1-2 godziny lub do całkowitego rozpuszczenia proszku.
- Przefiltrować w celu sterylizacji i przechowywać w 4°C.
Dyskusja
Zaadaptowaliśmy wysoce wydajny test tworzenia potworniaków w celu mapowania losów różnicujących się hESC w środowisku in vivo. Niewielka liczba specjalnie wybranych hESC jest mieszana z nieróżnicującymi się hESC typu dzikiego oraz lektyną z Phaseolus vulgaris w celu utworzenia pelletu komórkowego. Jest on następnie przeszczepiany pod torebkę nerki u myszy z niedoborem odporności. Losy pierwotnie wybranych hESC można następnie określić za pomocą immunohistochemii (Rycina 5), zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami (9). Metoda ta stanowi cenne narzędzie do identyfikacji i wytwarzania odczynników specyficznych tkankowo dla terapii komórkowych.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez Kompleksowy Grant Badawczy z California Institute for Regenerative Medicine (RC-00104), grant Public Health Service (HL085377) z NHLBI oraz darowiznę z Pollin Foundation dla H.S.B.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 2-metylo-2-butanol | Sigma-Aldrich | 240486 | Awertin |
| 2,2,2-tribromo–etanol | Sigma-Aldrich | T48402 | Avertin |
| nici jedwabne 4-0 | Ethicon Inc. | 641G | |
| bFGF | R&D Systems | 233FB | |
| Buprenorfina | Sigma-Aldrich | B7536 | |
| Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046-341 | |
| Kolagenaza IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| D-MEM | Invitrogen | 11965 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| pinceta Dupont nr 5 | World Precision Instruments, Inc. | 500233 | Torebka nerkowa |
| Eozyna Y | Fisher Scientific | 23-245-658 | |
| płodowa surowica bydlęca (kwalifikowana) | Invitrogen | 26140-079 | |
| Alkohol Flex | Fisher Scientific | 22-046344 | |
| Skrzela’Hematoksylina nr 3 | Fisher Scientific | 22-050-204 | |
| Kleszczyk hemostatyczny, prosty | World Precision Instruments, Inc. | 501241 | Chirurgia ogólna |
| Pinceta irydowa | World Precision Instruments, Inc. | 15914 | Chirurgia ogólna |
| Ketoprofen | Sigma-Aldrich | K2012 | |
| KnockOut D-MEM | Invitrogen | 10829 | |
| Zamiennik surowicy KnockOut | Invitrogen | 10828-028 | |
| L-glutamina | Invitrogen | 25020-081 | |
| inserty MILLICELL | EMD Millipore | PICM01250 | |
| Niezbędne aminokwasy niepodstawowe | Invitrogen | 11140-050 | |
| Nożyczki chirurgiczne | World Precision Instruments, Inc. | 501754 | Chirurgia ogólna |
| Parafina (TissuePrep) | Fisher Scientific | 8002-74-02 | |
| penicylina/streptomycyna | Invitrogen | 15140-122 | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| PHA | Sigma-Aldrich | L1668 | |
| Żelatyna wieprzowa | Sigma-Aldrich | G6144 | |
| inhibitor ROCK | Calbiochem | Y-27632 | |
| myszy SCID beige | Charles River Laboratories | 250 | |
| Scott’Płukanie | Fisher Scientific | 6697-32 | Ricca Chemicals |
| nożyczki sprężynowe Vannasa | World Precision Instruments, Inc. | 14003 | Torebka nerkowa |
| β-merkapto–etanol | Sigma-Aldrich | M7522 |
Bibliografia
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Hoof, D. V. an, D'Amour, K. A., German, M. S. Derivation of insulin-producing cells from human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 3, 73-87 (2009).
- Li, Z., Han, Z., Wu, J. C. Transplantation of human embryonic stem cell-derived endothelial cells for vascular diseases. J Cell Biochem. 106, 194-194 (2009).
- Safinia, N., Minger, S. L. Generation of hepatocytes from human embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 481, 169-180 (2009).
- Nury, D., Neri, T., Puceat, M. Human embryonic stem cells and cardiac cell fate. J Cell Physiol. 218, 455-459 (2009).
- Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Witmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).
- Schatten, G., Smith, J., Navara, C., Park, J. H., Pedersen, R. Culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 2, 455-463 (2005).
- Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- King, F. W., Ritner, C., Liszewski, W., Kwan, H. C., Pedersen, A., Leavitt, A. D., Bernstein, H. S. Subpopulations of human embryonic stem cells with distinct tissue-specific fates can be selected from pluripotent cultures. Stem Cells Dev. 18, 1441-1450 (2009).
- Cunha, G. R. Epithelio-mesenchymal interactions in primordial gland structures which become responsive to androgenic stimulation. Anat Rec. 172, 179-195 (1972).
- Kirsch, J. H., Klaus, J. A., Blizzard, K. K., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Pain evaluation and response to buprenorphine in rats subjected to sham middle cerebral artery occlusion. Contemp Top Lab Anim Sci. 41, 9-14 (2002).
- Lee-Parritz, D. Analgesia for rodent experimental surgery. Isr J Vet Med. 62, 74-78 (2007).
- Julou, L., Guyonnet, J. C., Ducrot, R., Pasquet, J. Some pharmacological and toxicological studies on ketoprofen. Rheumatol Rehabil. , Suppl 5-10. (1976).
Przedruki i uprawnienia
