Rejestrowanie zachowań wielokomórkowych w biofilmach Myxococcus xanthus za pomocą mikrokinematografii poklatkowej

Podsumowanie

Aby zbadać zachowanie roju Myxococcus xanthus, zaprojektowaliśmy protokół mikrokinematografii poklatkowej, który może być modyfikowany dla różnych testów. Wykorzystuje standardowe warunki wzrostu dostosowane do mikroskopii i daje powtarzalne wyniki dzięki zastosowaniu niedrogich, silikonowych uszczelek wielokrotnego użytku. Zastosowaliśmy tę metodę do ilościowego określenia chemotaksji wielokomórkowej.

Streszczenie

Rój δ-proteobacterium Myxococcus xanthus zawiera miliony komórek, które działają jak kolektyw, koordynując ruch poprzez serię sygnałów, tworząc złożone, dynamiczne wzorce w odpowiedzi na sygnały środowiskowe. Wzorce te są samoorganizujące się i emergentne; Nie można ich przewidzieć, obserwując zachowanie poszczególnych komórek. Korzystając z testu śledzenia mikrokinematografii poklatkowej, zidentyfikowaliśmy wyraźny wyłaniający się wzór u M. xanthus zwany chemotaksją, zdefiniowany jako skierowany ruch roju w górę gradientu składników odżywczych w kierunku źródła ¹.

Aby skutecznie scharakteryzować chemotaksję za pomocą mikrokinematografii poklatkowej, opracowaliśmy wysoce modyfikowalny kompleks płytek (Rysunek 1) i skonstruowaliśmy grupę 8 mikroskopów (Rysunek 2), z których każdy jest zdolny do rejestrowania filmów poklatkowych. Test jest wystarczająco rygorystyczny, aby umożliwić konsekwentną replikację wymiernych danych, a uzyskane filmy pozwalają nam obserwować i śledzić subtelne zmiany w zachowaniu roju. Po przechwyceniu filmy są przesyłane do komputera analitycznego/pamięci masowej z wystarczającą ilością pamięci do przetworzenia i przechowywania tysięcy filmów. Elastyczność tej konfiguracji okazała się przydatna dla kilku członków społeczności M. xanthus.

Protokół

Potrzebne materiały:

• Miernik Kletta
• Pipeta i końcówki
• Probówki do mikrowirówek o pojemności 2,5 ml
• Mikrowirówka
• Nośniki CTTYE:
  • 1,0% Casitone (Difco Laboratories), 0,5% ekstrakt drożdżowy (Difco Laboratories),
  • 10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM KH₂PO₄, 8,0 mM_MgSO4
• Nośniki TPM:
  • 10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM KH₂PO₄, 8,0 mM_MgSO4
• Agarozy
• Łaźnia wodna ustawiona na 55°C
• Szkiełka mikroskopowe szklane
• Duże szklane szkiełka nakrywkowe
• Uszczelka z gumy silikonowej 2 x 2 cm o grubości 0,5 mm (Grace Bio-Lab Inc.)
• Parafilm (lub taśma do etykietowania)
• Kleszcze
• Małe spinacze do segregatorów
• Pipeta do mikropobierania próbek (Fisher)
• Jednorazowa końcówka szklana 100 μl (Fisher)
• Chusteczki Kimwipes

Część 1: Przygotowanie komórek

Zacznij od stworzenia sterylnego środowiska.

• Czyste miejsce pracy, załóż rękawice i zapal palnik.

1. Rozpocznij nocną hodowlę komórek, zaszczepiając je w kolbie zawierającej bulion CTTYE i inkubując w ciemności w temperaturze 32°C z energicznym wirowaniem.
2. Gdy hodowla osiągnie gęstość 5 x 10⁸ komórek/ml, pipetować 1 ml komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2,5 ml.
3. Komórki osadu przez wirowanie przez 2 minuty przy 16 000 x g (lub maksymalnej prędkości).
4. Zdekantować i odrzucić supernatant.
5. Przemyj osad komórkowy 1 ml TPM (pożywka zbilansowana solą, bez składników odżywczych).
   • Ponowne zawieszenie i wirowanie
6. Ponownie granuluj komórki, wirując przez 2 minuty z prędkością 16 000 x g (lub maksymalną prędkością).
7. Zdekantować i odrzucić supernatant.
   
   ETAP KRYTYCZNY
   
   
8. Całkowicie ponownie zawiesić granulki w pożywce TPM o objętości 100 μl, łącząc pipetowanie i wirowanie.
   
   WAŻNE: Ten krok zapewnia, że w probówce nie pozostały żadne grudki komórek. Może to chwilę potrwać.
9. Odłóż komórki na bok w temperaturze pokojowej podczas przygotowywania płytek do śledzenia testów.

Część 2: Przygotowanie agaru

1. Przygotować 50 ml pożywki TPM (pożywki do oznaczania) i CTTYE (krążków odżywczych).
2. Dodaj 0,5 g agarozy do każdego (agaroza jest mniej dyfrakcyjna niż agar).
3. Autoklaw do sterylizacji.
4. Po sterylizacji należy utrzymywać pożywkę w temperaturze 55°C w inkubatorze (lub łaźni wodnej) podczas konstruowania kompleksów płytek do testów śledzących.

Część 3: Budowa dysku odżywczego

1. Umieść sterylną uszczelkę z gumy silikonowej o grubości 0,5 mm na sterylizowanym płomieniowo szklanym szkiełku mikroskopowym, tworząc małą studzienkę.
2. Odpipetować ~300 μl pożywki CTTYE/agarozy o temperaturze 55°C do studzienki utworzonej przez uszczelkę na szkiełku i zawierającej krążek odżywczy. Pożywka CTTYE/agaroza powinna się usypać.
3. Umieść szkiełko sterylizowane płomieniem (bez uszczelki) na podłożu CTTYE/agarozie.
   
   WAŻNE: Szkiełko to musi być ustawione pod kątem, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków.
4. Gdy suwak znajdzie się na miejscu, zaciśnij kompleks razem z mini spinaczami do segregatorów - po jednym z każdej strony.
5. Umieść strzyżony kompleks w temperaturze 4°C i pozwól pożywce CTTYE/agarozie stężyć. Zwykle zajmuje to około 5 minut.

Część 4: Przygotowanie do śledzenia testów - Konfiguracja kompleksów płytek

Złóż komponenty, przygotuj kompleksy szkiełek, umieść dysk odżywczy, wlej pożywkę TPM/agarozę, oddziel i osusz kompleksy płytek, komórki płytkowe i złóż kompleksy płytek do śledzenia

testów.

Złóż złożone komponenty płyty

1. Dla każdego kompleksu sterylizowano płomieniem szklane szkiełko mikroskopowe
2. Umieść autoklawowaną uszczelkę na szkiełku i odłóż na bok (wysterylizowaną stroną do góry). To utworzy dno testu.
3. Wysterylizuj płomieniowo szklane szkiełko nakrywkowe i umieść je na drugim szklanym szkiełku mikroskopowym owiniętym taśmą do etykietowania (lub Parafilmem) i odłóż na bok (wysterylizowaną stroną do góry). Jest on używany jako szkiełko podporowe, aby zapobiec pękaniu szkiełka nakrywkowego. Będzie to stanowić wierzchołek testu.
4. Wysterylizuj płomieniowo trzecie szklane szkiełko mikroskopowe i odłóż na bok (wysterylizowaną stroną do góry). Zostanie to wykorzystane do spłaszczenia agarozy.
   
   WAŻNE: Upewnij się, że uszczelki tworzą uszczelkę ze szkłem, dociskając je kleszczami, w przeciwnym razie media/agaroza może wyschnąć.

Umieść dysk odżywczy

WAŻNE: Kroki od 5 do 10 muszą być wykonywane na jednym kompleksie slajdów na raz; w przeciwnym razie media/agaroza mogą zacząć krzepnąć, co skutkuje słabą jakością filmu.

5. Usuń odżywczy kompleks krążków z formy 4°C (krok 5 z części 3) i podważ szkiełka, odsłaniając teraz zestalony CTTYE/agarozę.
6. Usunąć "krążek odżywczy" o średnicy 1 mm z opisanego powyżej dołka CTTYE/agarozy za pomocą pipety do mikropobierania próbek z jednorazową końcówką o pojemności 100 μl i umieścić go w studzience utworzonej przez uszczelkę na szkiełku nakrywkowym (krok 3 powyżej).

Nalej talerze

KRYTYCZNY KROK

7. Odpipetować ~300 μl pożywki TPM/agarozy o temperaturze 55°C do studzienki utworzonej przez uszczelkę na szkiełku nakrywkowym i zawierającej krążek odżywczy. Pożywka TPM/agaroza powinna się gromadzić.
   
   KROK KRYTYCZNY
8. Umieść szkiełko sterylizowane płomieniem bez uszczelki (z kroku 3) na wierzchu nośnika TPM/agarozy.
   
   WAŻNE: Szkiełko musi być ustawione pod kątem, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków.
   
   
9. Gdy szkiełko (z kroku 5) znajdzie się na swoim miejscu, zaciśnij kompleks razem z mini spinaczami do segregatorów - po jednym z każdej strony.
10. Umieść obcięty kompleks w temperaturze 4°C i pozwól pożywce/agarozie stężeniu. Zwykle zajmuje to około 5 minut.

Oddzielne i suche talerze

WAŻNE: Aby zapobiec wysychaniu podłoża/agarozy, kroki od 11 do 20 powinny być wykonywane tylko na jednym kompleksie szkiełek na raz.

WAŻNE: Aby uzyskać najlepsze wyniki, kroki od 11 do 13 należy wykonać w temperaturze 4°C.

11. Gdy podłoże/agaroza stwardnieją, usuń spinki do segregatora i ściśnij koniec kompleksu, aby poluzować szkiełko owinięte taśmą.
12. Zdejmij szkiełko owinięte taśmą i umieść je na stole do dalszego użytku.
    
    KROK KRYTYCZNY
13. Używając kleszczyków jako klina, oddziel szkiełko nakrywkowe/uszczelkę/podłoże/kompleks agarozy od szkiełka nośnego (bez uszczelki) i wyrzuć szkiełko podporowe.
    
    WAŻNE: Nie używaj ruchu podważającego do oddzielania kompleksu szkiełek nakrywkowych/uszczelki. Może to spowodować pęknięcie szkiełka nakrywkowego i/lub przyklejenie się mediów/agarozy do szkiełka nośnego.
14. Umieścić szkiełko nakrywkowe/uszczelkę/podłoże/kompleks agarozy na owiniętym taśmą szkiełku (uszczelką do góry) i zdjąć z 4°C. Umieść ten kompleks obok palnika, aby cała widoczna wilgoć odparowała z nowo odsłoniętej powierzchni media/agarozy - nie więcej niż 1 min.
    
    WAŻNE: Nie pozwól, aby podłoże/agaroza wyschły zbyt długo, ponieważ może to wpłynąć na zachowanie roju M. xanthus.

Płytki komórki

KRYTYCZNY KROK

1. Po odparowaniu nadmiaru wilgoci odpipetować 0,5 μl zagęszczonych komórek (krok 8 z części 1) na pożywkę/agarozę w odległości około 1 mm od krążka z pożywką.
   
   WAŻNE: Niezwykle ważne jest, aby upewnić się, że komórki zostały osadzone, przesuwając pipetę prosto w dół, a następnie prosto w górę. Gwarantuje to, że rój będzie okrągły.
   
   WAŻNE: Niezwykle ważne jest, aby nie dotykać końcówki pipety media/agarozy. Spowoduje to powstanie zagłębienia na powierzchni i zmieni zachowanie roju M. xanthus.
   
   WSKAZÓWKA: Wciśnij końcówkę pipety przed zbliżeniem się do podłoża/agarozy. Pozwoli to na pojawienie się kropli komórek na dnie końcówki pipety i ułatwi ich osadzanie.
2. Po osadzeniu komórek umieść kompleks obok palnika, aby miejsce ogniw wyschło - nie dłużej niż 20 sekund.

Złóż test

1. Po wyschnięciu plamki komórkowej wyrównaj kompleks suwaka/uszczelki (z kroku 1) z uszczelką na szkiełku nakrywkowym/uszczelce/pożywce/agarozie/kompleksie komórkowym (od kroku 13) i delikatnie dociśnij do siebie, aby utworzyć uszczelkę.
   
   KROK KRYTYCZNY
2. Oczyść powierzchnie szkiełka i szkiełka nakrywkowego za pomocą Kimwipe, aby usunąć pozostałości pozostawione przez Parafilm. Wypełniony test powinien przypominać rysunek 1.
3. Umieść gotowy kompleks szkiełek na podgrzewanym stoliku utrzymywanym w temperaturze 32°C (zsuń w dół, nakrywka do góry) natychmiast po wytarciu (krok 15), aby zapobiec tworzeniu się kondensatu. Jeśli doszło do kondensacji, pozostaw preparat na podgrzewanej scenie na kilka sekund przed uruchomieniem oprogramowania do akwizycji obrazu.
4. Wybierz odpowiedni obiektyw (2X, 4X lub 10X).

Część 5: Przygotowanie filmu

KRYTYCZNY KROK

1. Włącz aparat i mikroskop i sprawdź poziom światła (upewnij się, że światło nie jest zbyt intensywne). Uruchom komputer i otwórz program do pozyskiwania obrazów.
2. Kliknij okno obrazu na żywo i ustaw ostrość mikroskopu. Obraz powinien wyglądać podobnie do tego pokazanego na rysunku 3. Zwróć uwagę na jednolitą powierzchnię agaru.
3. Rozpocznij pobieranie images.
   
   KROK KRYTYCZNY
4. Regularnie sprawdzaj ostrość w ciągu pierwszej godziny, ponieważ podłoże/agar ma tendencję do osiadania, powodując dryf ostrości.
5. Czyste miejsce pracy.
6. Po zakończeniu akwizycji obrazu przenieś uzyskane obrazy do przechowywania i rozbij kompleks szkiełkowy, mocząc go w 90% etanolu przez noc.
7. Uszczelki autoklawu do ponownego użycia.

Rysunek 1. Ilustracja kreskówkowa kompleksu płyt TM. (A) pokazuje podstawowy kompleks płyt TM w widoku rozstrzelonym i przekroju poprzecznym. (B) pokazuje zastosowanie większych uszczelek.

Rysunek 2. Klaster mikroskopowy. Każdy węzeł mikroskopu (wstawka) składa się z mikroskopu Nikon E400, obiektywów, podgrzewanego stolika, kamery Insight i notebooka. Każdy węzeł jest połączony ze sobą w sieć i połączony z komputerem kontrolera głównego. Dwa z węzłów są wyposażone w funkcje fluorescencyjne, które składają się ze źródła światła EXFO i dwóch żaluzji Uniblitz.

Rysunek 3. 20-krotny obraz aparatury do śledzenia w czasie = 0. Podziałka liniowa, 1 mm.

Rysunek 4. Zdolność adaptacji kompleksu płyt TM. (A) 100-krotny obraz ruchliwości ślizgowej M. xanthus na CTTYE w 1,0% agarze (B) 20-krotny obraz drgającej ruchliwości P. aeruginosa. (C) 20-krotny obraz ruchliwości roju S. marcescens. Zarówno (B), jak i (C) oznaczano na LB w 1,0% agarze . (D) 40-krotny obraz ślizgowej ruchliwości M. smegmatis na LB w 0,5% agarze Obraz ten został wykonany przy użyciu alternatywnej konfiguracji testu widocznej na rys. 1B.

Wideo 1. Film poklatkowy przedstawiający rój poddany testowi śledzenia.

Wideo 2. Film poklatkowy roju M. xanthus, w którym 1% komórek jest znakowanych fluorescencyjnie. Uchwycono naprzemienne obrazy z kontrastem fazowym i fluorescencyjne i nałożono je na siebie, aby wyjaśnić położenie komórek fluorescencyjnych w roju. Ten film został nagrany na CTTYE w 1,0% agarze .

Wideo 3. Film poklatkowy przedstawiający ruchliwość ślizgową M. xanthus. Ten film został nagrany na CTTYE w 1,0% agarze .

Wideo 4. Film poklatkowy przedstawiający drgającą ruchliwość P. aeruginosa. Ten film został nagrany na LB w 1,0% agarze .

Wideo 5. Film poklatkowy przedstawiający ruchliwość roju S. marcescens. Ten film został nagrany na LB w 1,0% agarze .

Wideo 6. Film poklatkowy przedstawiający ruchliwość ślizgową M. smegmatis. Ten film został uchwycony na LB w 0,5% agarze przy użyciu alternatywnej konfiguracji testu widocznej na ryc. 1B.

Dyskusja

Mikrokinematografia poklatkowa (TM) stała się standardowym podejściem do badania motoryki prokariotycznej ^2-7. Tradycyjnie, TM wykonuje się przy użyciu z bibuły filtracyjnej, cienkich wacików agarowych lub płyt agarowych jako substratów ^8-11. Metody te są odpowiednie i opłacalne, gdy są używane do generowania sekwencji obrazów w celu uzyskania ogólnych ilustracji ruchu bakterii. Jeśli jednak sekwencje obrazów muszą prowadzić do wygenerowania powtarzalnych i ilościowo rygorystycznych danych, metody t...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1,0% Casitone	Difco Laboratories
0,5% ekstrakt drożdżowy	Difco Laboratories
Pipeta do mikropobierania próbek	Fisher Scientific
100 μ l szklana jednorazowa końcówka	Fisher Scientific
2 x 2 cm, uszczelka z gumy silikonowej o grubości 0,5 mm	Grace Bio-Lab Inc.