Aby zbadać zachowanie roju Myxococcus xanthus, opracowaliśmy protokół mikrokinematografii poklatkowej, który można modyfikować dla różnych analiz. Wykorzystuje on standardowe warunki hodowli dostosowane do mikroskopii i zapewnia powtarzalne wyniki dzięki zastosowaniu niedrogich, wielorazowych uszczelek silikonowych. Metodę tę wykorzystaliśmy do ilościowego określenia wielokomórkowego chemotaksy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Nagrywanie zachowań wielokomórkowych w biofilmach Myxococcus xanthus przy użyciu mikrocynematografii poklatkowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rój δ-proteobakterii Myxococcus xanthus składa się z milionów komórek działających jako kolektyw, które koordynują ruch poprzez serię sygnałów, tworząc złożone, dynamiczne wzorce w odpowiedzi na bodźce środowiskowe. Wzorce te są samoorganizujące się i emergentne; nie można ich przewidzieć, obserwując zachowanie pojedynczych komórek. Wykorzystując test śledzenia za pomocą mikrocinematografii poklatkowej, zidentyfikowaliśmy w M. xanthus wyraźny wzorzec emergentny zwany chemotaksją, zdefiniowaną jako ukierunkowany ruch roju w górę gradientu składników odżywczych w stronę ich źródła 1.
Aby efektywnie charakteryzować chemotaksję za pomocą mikrocinematografii poklatkowej, opracowaliśmy wysoce modyfikowalny zespół płytek (Rysunek 1) i zbudowaliśmy klaster 8 mikroskopów (Rysunek 2), z których każdy jest zdolny do rejestrowania filmów poklatkowych. Analiza ta jest na tyle rygorystyczna, że pozwala na spójną replikację mierzalnych danych, a uzyskane filmy umożliwiają obserwację i śledzenie subtelnych zmian w zachowaniu roju. Po zarejestrowaniu filmy są przenoszone na komputer do analizy i przechowywania, który posiada wystarczającą pamięć do przetwarzania i archiwizowania tysięcy nagrań. Elastyczność tej konfiguracji okazała się przydatna dla wielu członków społeczności badającej M. xanthus.
Protokół
Wymagane materiały:
- Klettometr
- Pipeta i końcówki
- Probówki do mikrocentryfugi 2,5 ml
- Mikrocentryfuga
- Pożywka CTTYE:
- 1,0% Casitone (Difco Laboratories), 0,5% ekstraktu drożdżowego (Difco Laboratories),
- 10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM KH2PO4, 8,0 mM MgSO4
- Pożywka TPM:
- 10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM KH2PO4, 8,0 mM MgSO4
- Agaroza
- Kąpiel wodna ustawiona na 55°C
- Szklane szkiełka przedmiotowe
- Duże szklane szkiełka nakrywkowe
- Uszczelka z gumy silikonowej 2 x 2 cm o grubości 0,5 mm (Grace Bio-Lab Inc.)
- Parafilm (lub taśma etykietująca)
- Pinceta
- Małe żabki biurowe
- Pipeta do mikropróbkowania (Fisher)
- Szklana jednorazowa końcówka 100 μl (Fisher)
- Chusteczki Kimwipes
Część 1: Przygotowanie komórek
Zacznij od przygotowania sterylnego środowiska.
- Oczyścić stanowisko pracy, założyć rękawiczki i zapalić palnik.
- Przygotować nocną hodowlę komórek poprzez inokulację do kolby zawierającej bulion CTTYE i inkubację w ciemności w temperaturze 32°C przy intensywnym wytrząsaniu.
- Po osiągnięciu przez hodowlę gęstości 5 x 108 komórek/ml, pipetować 1 ml komórek do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2,5 ml.
- Zwirwić komórki poprzez wirowanie przez 2 min przy 16 000 x g (lub z maksymalną prędkością).
- Odlać i usunąć nadsącz.
- Przemyć osad komórkowy 1 ml TPM (medium zrównoważone solnie, bez składników odżywczych).
- resuspender i wymieszać w wortexie
- Ponownie zwirować komórki przez 2 min przy 16 000 x g (lub z maksymalną prędkością).
- Odlać i usunąć nadsącz.
KROK KRYTYCZNY
- Całkowicie resuspender osad w 100 μl medium TPM, łącząc pipetowanie z mieszaniem w wortexie.
WAŻNE: Krok ten zapewnia brak skupisk komórek w probówce. Może to zająć trochę czasu. - Odstawić komórki w temperaturze pokojowej na czas przygotowania płytek do testu śledzenia.
Część 2: Przygotowanie agaru
- Przygotować po 50 ml pożywek TPM (pożywka do testu) i CTTYE (do dysków odżywczych).
- Do każdej z nich dodać 0,5 g agarozy (agaroza wykazuje mniejszą dyfrakcję niż agar).
- Sterylizować w autoklawie.
- Po sterylizacji utrzymywać pożywki w temperaturze 55°C w inkubatorze (lub kąpieli wodnej) podczas przygotowywania kompleksów płytek do testu śledzenia.
Część 3: Konstrukcja dysku odżywczego
- Umieść sterylną uszczelkę z gumy silikonowej o grubości 0,5 mm na wierzchu wysterylizowanego nad palnikiem szkiełka przedmiotowego, tworząc niewielki dołek.
- Pipetuj ~300 μl podłoża CTTYE z agarozą o temperaturze 55°C do dołka utworzonego przez uszczelkę na szkiełku zawierającym dysk odżywczy. Podłoże CTTYE z agarozą powinno utworzyć wypukłość.
- Połóż wysterylizowane nad palnikiem szkiełko (bez uszczelki) na wierzchu podłoża CTTYE z agarozą.
WAŻNE: Szkiełko należy kłaść pod kątem, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza. - Po umieszczeniu szkiełka zaciśnij cały zespół za pomocą mini-klipsów biurowych – po jednym z każdej strony.
- Umieść zapięty zespół w temperaturze 4°C i poczekaj, aż podłoże CTTYE z agarozą stężeje. Zazwyczaj trwa to około 5 min.
Część 4: Przygotowanie testu śledzenia – przygotowanie kompleksów na płytce
Złożyć komponenty, przygotować kompleksy na szkiełkach, umieścić dysk odżywczy, wlać medium TPM/agarozę, rozdzielić i osuszyć kompleksy płytek, wysiać komórki oraz złożyć kompleksy płytek do testu śledzenia.
Złóż komponenty kompleksu płytki
- Dla każdego kompleksu wysterylizuj szkiełko przedmiotowe nad płomieniem
- Umieść autoklawowaną uszczelkę na górze szkiełka i odstaw (stroną sterylną do góry). Będzie ona stanowić dno układu pomiarowego.
- Wysterylizuj nad płomieniem szkiełko nakrywkowe i umieść je na drugim szkiełku przedmiotowym owiniętym taśmą etykietującą (lub Parafilmem), a następnie odstaw (stroną sterylną do góry). Służy ono jako szkiełko wsporcze, aby zapobiec pękaniu nakrywki. Będzie ono stanowić górną część układu pomiarowego.
- Wysterylizuj nad płomieniem trzecie szkiełko przedmiotowe i odstaw (stroną sterylną do góry). Będzie ono służyć do spłaszczania agarozy.
WAŻNE: Upewnij się, że uszczelki tworzą szczelne połączenie ze szkłem, dociskając je pęsetą; w przeciwnym razie medium/agaroza mogą wyschnąć.
Umieść dysk odżywczy
WAŻNE: Kroki od 5 do 10 muszą być wykonywane na jednym kompleksie szkiełek na raz; w przeciwnym razie medium/agaroza mogą zacząć tężeć, co spowoduje niską jakość nagrania.
- Wyjąć kompleks dysku odżywczego z temperatury 4°C (krok 5 z części 3) i rozdzielić szkiełka, odsłaniając zastygłe medium CTTYE/agarozę.
- Za pomocą pipety mikrootbiorczej z jednorazową szklaną końcówką 100 μl pobrać „dysk odżywczy” o średnicy 1 mm z opisanego powyżej otworu z medium CTTYE/agarozą i umieścić go w zagłębieniu utworzonym przez uszczelkę na szkiełku nakrywkowym (krok 3 powyżej).
Zalewanie płytek
KROK KRYTYCZNY
- Pipetuj ~300 μl podłoża TPM/agarozy o temperaturze 55°C do zagłębienia utworzonego przez uszczelkę na szkiełku nakrywce, w którym znajduje się dysk odżywczy. Podłoże TPM/agaroza powinno utworzyć wypukłość.
KROK KRYTYCZNY - Umieść wysterylizowane płomieniem szkiełko bez uszczelki (z kroku 3) na wierzchu podłoża TPM/agarozy.
WAŻNE: Szkiełko należy kłaść pod kątem, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza.
- Po umieszczeniu szkiełka (z kroku 5) zaciśnij cały kompleks za pomocą mini-klipsów biurowych – po jednym z każdej strony.
- Umieść zaciśnięty kompleks w temperaturze 4°C i pozostaw podłoże/agarozę do zastygnięcia. Zazwyczaj trwa to około 5 min.
Rozdzielenie i osuszenie płytek
WAŻNE: Aby zapobiec wysychaniu podłoża/agarozy, kroki od 11 do 20 należy wykonywać tylko na jednym kompleksie slajdków jednocześnie.
WAŻNE: Dla uzyskania najlepszych wyników kroki od 11 do 13 należy przeprowadzić w temperaturze 4°C.
- Po zastygnięciu medium/agarozy należy zdjąć żabki biurowe i ścisnąć koniec kompleksu, aby poluzować szkiełko owinięte taśmą.
- Należy wyjąć szkiełko owinięte taśmą i położyć je na blacie do dalszego użytku.
KROK KRYTYCZNY - Używając pęsety jako klin, należy oddzielić kompleks szkiełka nakrywkowego/uszczelki/medium/agarozy od szkiełka podpierającego (bez uszczelki), a następnie wyrzucić szkiełko podpierające.
WAŻNE: Nie należy używać ruchu dźwigniowego do oddzielania kompleksu szkiełka nakrywkowego/uszczelki. Może to doprowadzić do pęknięcia szkiełka nakrywkowego i/lub przyklejenia się medium/agarozy do szkiełka podpierającego. - Należy położyć kompleks szkiełka nakrywkowego/uszczelki/medium/agarozy na szkiełku owiniętym taśmą (stroną uszczelki do góry) i wyjąć z temperatury 4°C. Kompleks ten należy umieścić obok palnika, aby pozwolić na odparowanie całej widocznej wilgoci z nowo odsłoniętej powierzchni medium/agarozy – nie dłużej niż 1 min.
WAŻNE: Nie wolno dopuścić do zbyt długiego wysychania medium/agarozy, ponieważ może to wpłynąć na zachowanie roju M. xanthus.
Wysianie komórek
KROK KRYTYCZNY
- Po odparowaniu nadmiaru wilgoci, nanieś pipetą 0,5 μl skoncentrowanych komórek (krok 8 z części 1) na podłoże/agarozę w odległości około 1 mm od dysku z substancjami odżywczymi.
WAŻNE: Niezwykle ważne jest, aby komórki nanosić, poruszając pipetą pionowo w dół, a następnie pionowo w górę. Zapewnia to okrągły kształt roju.
WAŻNE: Niezwykle ważne jest, aby nie dotykać końcówki pipety do podłoża/agarozy. Spowoduje to powstanie wgłębienia na powierzchni i zmieni zachowanie roju M. xanthus.
WSKAZÓWKA: Naciśnij końcówkę pipety przed zbliżeniem jej do podłoża/agarozy. Dzięki temu na spodzie końcówki pipety pojawi się kropla komórek, co ułatwi ich naniesienie. - Po naniesieniu komórek umieść zestaw obok palnika, aby plamka z komórkami wyschła – nie dłużej niż przez 20 sec.
Przygotowanie testu
- Po wyschnięciu plamki z komórkami, dopasuj zespół szkiełko/uszczelka (z kroku 1) do uszczelki w zespole szkiełko nakrywkowe/uszczelka/medium/agaroza/komórki (z kroku 13) i delikatnie dociśnij, aby utworzyć szczelne połączenie.
KROK KRYTYCZNY - Oczyść powierzchnie szkiełka i nakrywki za pomocą chusteczki Kimwipe, aby usunąć pozostałości Parafilmu. Gotowy układ do analizy powinien wyglądać jak na Rysunku 1.
- Bezpośrednio po przetarciu (krok 15), umieść gotowy zespół szkiełek na podgrzewanym stoliku ustawionym na 32°C (szkiełko na dole, nakrywka na górze), aby zapobiec skraplaniu się pary wodnej. Jeśli pojawiła się kondensacja, pozostaw zespół szkiełek na podgrzewanym stoliku przez kilka sekund przed uruchomieniem oprogramowania do akwizycji obrazu.
- Wybierz odpowiedni obiektyw (2X, 4X lub 10X).
Część 5: Przygotowanie filmu
KROK KRYTYCZNY
- Włącz kamerę oraz mikroskop i sprawdź poziom oświetlenia (upewnij się, że światło nie jest zbyt intensywne). Uruchom komputer i otwórz program do akwizycji obrazu.
- Kliknij w oknie obrazu na żywo i ustaw ostrość mikroskopu. Obraz powinien być zbliżony do widocznego na Rysunku 3. Zwróć uwagę na jednorodną powierzchnię agaru.
- Rozpocznij akwizycję obrazów.
KROK KRYTYCZNY - Regularnie sprawdzaj ostrość podczas pierwszej godziny, ponieważ podłoże/agar ma tendencję do osiadania, co powoduje rozregulowanie ostrości.
- Uporządkuj stanowisko pracy.
- Po zakończeniu akwizycji obrazów przenieś je do pamięci trwałej, a następnie rozdziel zestaw preparatu poprzez namaczanie w 90% etanolu przez noc.
- Zautoklawuj uszczelki w celu ich ponownego wykorzystania.
Rysunek 1. Schematyczny rysunek kompleksu płytki TM. (A) przedstawia podstawowy kompleks płytki TM w widoku rozstrzelonym i w przekroju. (B) przedstawia zastosowanie większych uszczelek.
Rycina 2. Klaster mikroskopowy. Każdy węzeł mikroskopowy (wstawka) składa się z mikroskopu Nikon E400, obiektywów, grzanego stolika, kamery Insight oraz laptopa. Każdy węzeł jest połączony w sieć i sprzężony z komputerem sterującym. Dwa z węzłów zostały wyposażone w funkcje fluorescencyjne, na które składają się źródło światła EXFO oraz dwa migawki Uniblitz.
Rysunek 3. Obraz z 20-krotnym powiększeniem aparatury do testu śledzenia w czasie t = 0. Pasek skali, 1 mm.
Rycina 4. Adaptacyjność kompleksu płyty TM. (A) obraz przy powiększeniu 100X przedstawiający ruch ślizgowy M. xanthus na podłożu CTTYE z 1,0% agarem. (B) obraz przy powiększeniu 20X przedstawiający ruch drgający P. aeruginosa. (C) obraz przy powiększeniu 20X przedstawiający ruch rojący S. marcescens. Oba testy (B) i (C) przeprowadzono na podłożu LB z 1,0% agarem. (D) obraz przy powiększeniu 40X przedstawiający ruch poślizgowy M. smegmatis na podłożu LB z 0,5% agarem. Obraz ten został wykonany przy użyciu alternacyjnej konfiguracji testowej przedstawionej na Ryc. 1B.
Wideo 1. Film poklatkowy przedstawiający rój poddany testowi śledzenia.
Film 2. Film poklatkowy roju M. xanthus, w którym 1% komórek jest znakowanych fluorescencyjnie. Naprzemiennie rejestrowano obrazy w kontraście fazowym i fluorescencyjne, a następnie nakładano je na siebie, aby wyjaśnić położenie komórek fluorescencyjnych w obrębie roju. Film ten został zarejestrowany na podłożu CTTYE z 1,0% agarem.
Wideo 3. Film poklatkowy przedstawiający ruch ślizgowy M. xanthus. Wideo zostało zarejestrowane na podłożu CTTYE z 1,0% agarem.
Wideo 4. Film w przyspieszonym tempie przedstawiający ruchy typu twitching P. aeruginosa. Wideo zostało zarejestrowane na podłożu LB z 1,0% agarem.
Wideo 5. Film poklatkowy przedstawiający ruchy swarmingowe S. marcescens. Wideo zostało zarejestrowane na podłożu LB z 1,0% agarem.
Wideo 6. Film poklatkowy przedstawiający ruch ślizgowy M. smegmatis. Wideo zostało zarejestrowane na podłożu LB z 0,5% agarem, przy użyciu alternacyjnej konfiguracji testu pokazanej na rys. 1B.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Mikrocinematografia poklatkowa (TM) stała się standardową metodą badania ruchliwości prokariotów 2-7. Tradycyjnie TM wykonuje się, wykorzystując w jakość podłoża knoty z papieru filtracyjnego, cienkie podkładki agarowe lub płyty agarowe 8-11. Metody te są wystarczające i efektywne kosztowo, gdy są stosowane do generowania sekwencji obrazów służących jako ogólne ilustracje ruchu bakterii. Jednakże, jeśli sekwencje obrazów mają służyć do generowania powtarzalnych i ilościowo rygorystycznych danych, me...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Badania te zostały sfinansowane z grantu National Science Foundation Career award (MCB-0746066, Characterization of Transcriptional Activators that Regulate Emergent Behavior) przyznanego R.D.W.
Jesteśmy wdzięczni L. J. Shimkusowi, B. S. Goldmanowi, G. Suenowi, M. Singerowi, L. G. Welchowi, K. A. Murphy'emu i H. G. Taylorowi za pomocne dyskusje i uwagi do rękopisu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1,0% Casitone | Difco Laboratories | ||
| 0,5% ekstraktu drożdżowego | Difco Laboratories | ||
| Pipeta do mikropróbkowania | Fisher Scientific | ||
| Jednorazowa szklana końcówka 100 μl | Fisher Scientific | ||
| Silikonowa uszczelka gumowa 2 x 2 cm o grubości 0,5 mm | Grace Bio-Lab Inc. |
Bibliografia
- Taylor, R. G., Welch, R. D. Chemotaxis as an emergent property of a swarm. J Bacteriol. 190, 6811-6816 (2008).
- Curtis, P. D., Taylor, R. G., Welch, R. D., Shimkets, L. J. Spatial Organization of Myxococcus xanthus During Fruiting Body Formation. J Bacteriol. 189, 9126-9130 (2007).
- Mignot, T., Merlie, J. P., Zusman, D. R. Regulated pole-to-pole oscillations of a bacterial gliding motility protein. Science. 310, 855-857 (2005).
- Stoodley, P., Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. M. Detachment surface migration, and other dynamic behavior in bacterial biofilms revealed by digital time-lapse imaging. Methods Enzymol. 337, 306-319 (2001).
- O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm formation as microbial development. Annu Rev Microbiol. 54, 49-79 (2000).
- O'Toole, G. A., Kolter, R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol Microbiol. 30, 295-304 (1998).
- Dalton, H. M., Poulsen, L. K., Halasz, P., Angles, M. L. Substratum-induced morphological changes in a marine bacterium and their relevance to biofilm structure. J Bacteriol. 176, 6900-6906 (1994).
- Dworkin, M., Eide, D. Myxococcus xanthus does not respond chemotactically to moderate concentration gradients. J Bacteriol. 154, 437-442 (1983).
- Dworkin, M. Tactic behavior of Myxococcus xanthus. J Bacteriol. 154, 452-459 (1983).
- Wu, S. S., Kaiser, D. Regulation of expression of the pilA gene in Myxococcus xanthus. J Bacteriol. 179, 7748-7758 (1997).
- Bustamante, V. H., Martínez-Flores, I., Vlamakis, H. C., Zusman, D. R. Analysis of the Frz signal transduction system of Myxococcus xanthus shows the importance of the conserved C-terminal region of the cytoplasmic chemoreceptor FrzCD in sensing signals. Mol Microbiol. 53, 1501-1513 (2004).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
