Wizualizacja i kwantyfikacja interakcji wewnątrzkomórkowych Neisseria meningitidis i ludzkiej α-aktyniny za pomocą obrazowania konfokalnego

Summary

Neisseria meningitidis (Nm), Gram-ujemny patogen układu oddechowego specyficzny dla człowieka, może wiązać się z ludzką α-aktyniną. W niniejszej pracy przedstawiono protokół wizualizacji kolokalizacji bakterii z wewnątrzkomórkową α-aktyniną po wniknięciu bakterii do komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu człowieka (HBMEC).

Abstract

Białko Opc Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) jest integralnym białkiem błony zewnętrznej wyrażonym powierzchniowo, które może działać jako adhezyna i skuteczny inwazyna dla ludzkich komórek nabłonka i śródbłonka. Zidentyfikowaliśmy śródbłonkowe integryny zlokalizowane na powierzchni jako główne receptory dla Opc, procesu, który wymaga, aby Opc najpierw związał się z ligandami integryny, takimi jak witronektyna, a następnie przez nie z receptorami wyrażającymi ekspresję komórkową¹. Proces ten prowadzi do inwazji bakteryjnej komórek śródbłonka². Niedawno zaobserwowaliśmy interakcję OPC z białkiem 100 kDa znajdującym się w lizatach całych komórek komórek ludzkich³. Początkowo zaobserwowaliśmy tę interakcję, gdy białka komórek gospodarza oddzielone za pomocą elektroforezy i osuszone na nitrocelulozie zostały pokryte Nm wykazującym ekspresję OPC. Oddziaływanie było bezpośrednie i nie obejmowało cząsteczek pośrednich. Za pomocą spektrometrii mas ustaliliśmy tożsamość białka jako α-aktyniny. Ponieważ na żadnej z ośmiu badanych linii komórkowych nie znaleziono powierzchniowej ekspresji α-aktyniny, a interakcje OPC z komórkami śródbłonka w obecności surowicy prowadzą do wnikania bakterii do komórek docelowych, zbadaliśmy możliwość interakcji tych dwóch białek wewnątrzkomórkowych. W tym celu hodowane komórki śródbłonka mikronaczyniowego ludzkiego mózgu (HBMEC) zostały zakażone Nm eksprymującym Opc przez dłuższy czas, a lokalizacje zinternalizowanych bakterii i α-aktininy zbadano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Zaobserwowaliśmy zależny od czasu wzrost kolokalizacji Nm z białkiem cytoszkieletu, który był znaczny po ośmiogodzinnym okresie internalizacji bakterii. Ponadto zastosowanie oprogramowania do obrazowania ilościowego umożliwiło nam uzyskanie względnego pomiaru kolokalizacji Nm z α-aktyniną i innymi białkami cytoszkieletu. W niniejszej pracy przedstawiono protokół wizualizacji i kwantyfikacji kolokalizacji bakterii z białkami wewnątrzkomórkowymi po wniknięciu bakterii do komórek śródbłonka człowieka, chociaż procedura ma również zastosowanie do komórek nabłonka człowieka.

Protocol

1. Protokół immunofluorescencji

Siew, infekcje i barwienie immunologiczne

Następujące procedury wymagają odpowiedniego poziomu bezpieczeństwa: hodowli tkankowej i mikrobiologicznych urządzeń laboratoryjnych.

DZIEŃ 1

A.Przygotowanie komórek docelowych do infekcji

1. Wysiewaj HBMEC przy 50% konfluencji (~1,5x10⁴ komórki/cm²) na szklanych szkiełkach nakrywkowych (średnica 16 mm) umieszczonych na 12-dołkowej płytce (3,8 cm² obszar wzrostu/dołek).
   
   Pożywka wzrostowa: RPMI 1640 uzupełniona 15% inaktywowanym termicznie (56 °C, 30 min) FBS, 2 mM glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 100 U/ml penicyliny/streptomycyny, 1% (v/v) roztworu aminokwasów endogennych MEM i 1% roztworu witamin MEM.
2. Hodowla przez noc (O/N) w temperaturze 37°C, w inkubatorze o stężeniu 5%_CO2
.

B. Kultura bakteryjna

1. Uprawiaj interesującą Cię odmianę O/N (16-18 h) na wymaganym podłożu, np. płytkach agarowych Brain Heart Infusion (BHI) uzupełnionych 10% podgrzaną krwią końską w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO₂ ⁴.

DZIEŃ 2

A. Przygotowanie zawiesiny bakteryjnej (N. meningitidis)

1. Używając pętli hodowlanej o objętości 10 μl, należy sporządzić zawiesinę nocnej kultury bakteryjnej w 2 ml PBSB (PBS z wapniem i magnezem).
2. Pozwól, aby duże agregaty bakteryjne osiadły, pozostawiając zawiesinę na 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
3. Nie naruszając osadu, przenieść górny 1 ml zawiesiny (inokulum podstawowe) do sterylnej probówki.
4. Aby oszacować liczbę bakterii w inokulum podstawowym, dodaj podwielokrotności (20-50 μl) do probówek zawierających 1 ml objętości 1% SDS w 0,1 M NaOH i delikatnie wymieszaj do rozpuszczenia.
5. Zmierzyć zawartość kwasu nukleinowego w roztworze, oznaczając absorbancję przy 260 nm (A260). W naszych rękach A260 z 1 odpowiada 5x10⁸ jednostkom tworzącym kolonie/ml (jtk/ml). Można to zweryfikować poprzez przygotowanie serii rozcieńczeń inokulum podstawowego w PBSB, posiew na płytkach agarowych i zliczenie kolonii po inkubacji O/N.
6. Rozcieńczyć podwielokrotność podstawowego inokulum w pożywce infekcyjnej [(M199 uzupełnionej 2% zdekomplementowaną (56°C, 30 min) normalną surowicą ludzką (NHS)] w celu uzyskania wymaganej gęstości bakteryjnej do zakażenia komórek docelowych.
   1. W naszym laboratorium rutynowo stosuje się współczynnik infekcji wynoszący 200-300 bakterii na komórkę docelową.

B. Zakażenie kulturą komórkową

1. Umyj szkiełka nakrywkowe z hodowanymi komórkami docelowymi 3 razy pożywką Hanka, aby usunąć wszelkie ślady antybiotyków.
2. Infekować komórki świeżo przygotowanymi zawiesinami bakteryjnymi (opisanymi powyżej) przez 3 h do 8 h w temperaturze 37°C, w 5% CO₂ .
3. Pod koniec okresu infekcji przemyć komórki trzykrotnie PBS i utrwalić w 500 μl 2% paraformaldehydu (PFA) przez 30-45 minut w temperaturze pokojowej lub O/N w temperaturze 4°C.
   1. Stwierdzono, że wiązanie paraformaldehydu w stężeniu i czasie pokazanym powyżej jest odpowiednie dla zachowania morfologii bakteryjnej i komórkowej.
4. Po zmyciu paraformaldehydu należy przepuścić komórki utrwalone w paraformaldehydzie przez inkubację w 0,1% Triton X-100 rozcieńczonym w PBS przez 10 minut.
5. Umyć próbki 3 razy za pomocą PBS.
6. Przystąp do barwienia immunologicznego lub, alternatywnie, pozostaw próbki w 500 μl 1% BSA/PBST O/N w temperaturze 4°C.

DZIEŃ 3

Barwienie immunologiczne

Barwienie wewnątrzkomórkowych bakterii i α-aktyniny może być wykonywane sekwencyjnie lub jednocześnie przy użyciu odpowiednich pierwszorzędowych i drugorzędowych przeciwciał w następujący sposób; wszystkie procedury można przeprowadzić na płytkach 12-dołkowych.

1. Zablokować szkiełka nakrywkowe zawierające przepuszczalne komórki 500 μl 3% BSA/PBST (PBS zawierający 0,05% Triton X-100) na 30-60 minut w temperaturze pokojowej
2. Po umyciu PBS przenieść każde szkiełko nakrywkowe do nowego suchego dołka w płytce 12-dołkowej.
3. Dodać pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko bakteriom i α-aktyninę; osiemdziesiąt do 100 μl przeciwciała na szkiełko nakrywkowe jest wystarczające, jeśli zostanie dodane ostrożnie, aby pokryć powierzchnię szkiełka nakrywkowego. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   1. Jednocześnie zastosowaliśmy króliczą poliklonalną surowicę przeciwko Neisseria meningitidis (hodowaną laboratoryjnie) i mysie przeciwciało monoklonalne (mAb) przeciwko α-aktininie (Abcam). W niektórych eksperymentach zamiast anty α-aktyniny stosowano mAb przeciwko aktynie lub wimentynie (Sigma).
4. Pod koniec inkubacji dodać 200 μl PBS do studzienki, podnieść szkiełko nakrywkowe i umieścić w nowym dołku zawierającym 500 μl PBS.
5. Po 5 minutach usunąć PBS za pomocą pipetowania, a następnie dodać świeży PBS. Powtórz dwa razy. Przenieś szkiełka nakrywkowe do nowej suchej studzienki.
6. Dodać odpowiednie przeciwciała drugorzędowe sprzężone z różnymi fluorochromami rozcieńczonymi w 1% BSA/PBST; inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w ciemności.
   1. Do wykrywania bakterii użyliśmy anty-króliczego Ig sprzężonego z TRITC, a do wykrywania α-aktyniny i innych białek cytoszkieletu użyliśmy anty-mysiego Ig skoniugowanego z FITC- (Sigma) lub Alexa Fluor 488- (Invitrogen).
7. Pod koniec inkubacji umyć jak w krokach 4 i 5.
8. Barwienie przeciw barwieniu 0,6 μg/ml DAPI w PBS (barwienie DNA) przez 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
9. Spłucz PBS.
10. Zamontuj szkiełka nakrywkowe (komórki skierowane w dół) na szkiełkach z kroplą podłoża montażowego (np. Mowiol lub Vectashield)
11. Przechowywać w ciemności w temperaturze 4°C.
12. Próbki są gotowe do obserwacji pod mikroskopem.

2. Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa (CLSM)

Aby obserwować i rejestrować obrazy wewnątrzkomórkowych bakterii i elementów cytoszkieletu, użyliśmy próbek znakowanych immunologicznie i przechwyciliśmy obrazy za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego Leica SP5-AOBS podłączonego do odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego Leica DM I6000. Wszystkie zdjęcia zostały wykonane przy użyciu obiektywu zanurzeniowego z olejkiem 63x NA 1.4 i wykonane z oprogramowaniem Leica.

Procedura CLSM:

1. Aby rozpocząć procedurę CLSM, dodaj kroplę olejku immersyjnego do obiektywu i umieść szkiełko z próbką, szkiełkiem nakrywkowym do dołu, na stoliku mikroskopu.
2. Ustaw mikroskop w trybie wizualnym i znajdź obszar zainteresowania za pomocą okularów mikroskopu.
3. Korzystając z oprogramowania Leica, wybierz tryb akwizycji xyz.
4. Wybierz format 512 x 512 (rozmiar klatki). W przypadku badań kolokalizacyjnych im wyższa rozdzielczość, tym dokładniejszy obraz; mając na uwadze limit rozdzielczości mikroskopu. Następnie wybierz dwukierunkowy tryb X, który zwiększy prędkość skanowania i pomoże zmniejszyć fotowybielanie.
5. Skonfiguruj ustawienia skanowania sekwencyjnego. Kliknij funkcję "seq" i wybierz jeden z trybów skanowania. Korzystamy z trybu "między wierszami".
6. Dobierz wiązki laserowe zgodnie z fluorochromami sprzężonymi z przeciwciałami drugorzędowymi: 405 nm dla DAPI (niebieski), 488 nm dla Alexa Fluor 488 (zielony) i 561 nm dla TRITC (czerwony). Aktywuj fotopowielacz (PMT) odpowiednio 1, 2 i 3. Dostosuj ustawienia PMT, aby wykryć prawidłową długość fali emisji.
7. Ustaw górną ("początek") i dolną ("koniec") stosów z lub serii. Następnie ustaw wymagany rozmiar "kroku z".
   1. Neisseria meningitidis jest diplococcus (ryc. 1G), a ponieważ każdy ziarniak ma przybliżoną średnicę 0,5 μm, rozmiar kroku z wynoszący 0,20 μm został wybrany, aby zwiększyć prawdopodobieństwo skanowania każdego ziarniaka co najmniej dwukrotnie. Mieści się również w rozmiarze kroku dla optymalnej rozdzielczości 0,1 - 0,2 μm.
8. Ustaw końcowe parametry skanowania, wybierając uśrednianie linii 3, aby poprawić stosunek sygnału do szumu.
9. Klikając "start", podwójnie lub potrójnie wybarwione obrazy są uzyskiwane przez sekwencyjne skanowanie na różnych długościach fal w celu wyeliminowania przesłuchów między różnymi chromoforami.
10. Aby wskazać kolokalizację dwóch fluorochromów, wybierz funkcję "nakładanie", aby połączyć wybrane kanały w jeden obraz; na przykład, gdy zarówno fluorochromy Alexa 488 (zielony), jak i TRITC (czerwony) kolokalizują się, na nałożonym obrazie pojawi się kolor żółty.
11. Kompiluj stosy lub serie z wykorzystaniem funkcji "maksymalnej projekcji" do budowy obrazu 2D wymaganego do wizualizacji możliwej kolokalizacji. Bardziej szczegółową analizę kolokalizacji można uzyskać poprzez analizę każdego przekroju optycznego.
12. Po uzyskaniu stosów z lub serii przetworzyć dane, aby uzyskać obraz ortogonalny do wizualizacji wewnątrzkomórkowej lokalizacji różnych elementów (rysunek 1E).

3. Kwantyfikacja kolokalizacji

Analizy statystyczne obrazów z konfokalnego mikroskopu skaningowego są wykonywane za pomocą oprogramowania Volocity (Improvision, PerkinElmer). To oprogramowanie stanowi narzędzie zaprojektowane specjalnie do analizy kolokalizacji, zgodnie z opisem Mandersa i wsp.(1993)⁵. Kolokalizację w kontekście cyfrowego obrazowania fluorescencyjnego można opisać jako detekcję sygnału w tym samym miejscu woksela (objętości piksela) w każdym kanale. Dwa kanały składają się z obrazów dwóch różnych fluorochromów pobranych z tego samego obszaru próbki (podręcznik użytkownika Volocity). Analizy statystyczne wykonywane są za pomocą oprogramowania Volocity (Improvision, PerkinElmer) z wykorzystaniem Ilościowej Analizy Kolokalizacyjnej opisanej poniżej.

Ilościowa analiza kolokalizacji

1. Utwórz bibliotekę z obrazami CLSM za pomocą oprogramowania Volocity.
2. Wybierz "rozszerzona ostrość" z obrazu na górnym pasku. To narzędzie skompiluje stosy z na obrazie 2D do analizy.
3. Wybierz narzędzie "Kolokalizacja". Dwa analizowane kanały powinny mieć tę samą głębię kolorów.
4. Wybierz obszar, który ma zostać określony ilościowo. Ustaw próg, aby usunąć dowolne tło.
5. Utwórz dane wyjściowe kolokalizacji, wybierając opcję "generuj kolokalizację". Statystyki kolokalizacji są generowane dla wybranych wcześniej obszarów zainteresowania.
6. Wybierz współczynniki Mandersa R (współczynnik nakładania się) i My (współczynnik kolokalizacji).
   1. Współczynniki Mandersa nie są wrażliwe na intensywność barwienia, ponieważ są znormalizowane w stosunku do całkowitej intensywności pikseli, dlatego można je zastosować, gdy barwienie jednego antygenu jest silniejsze niż drugiego.
   2. Współczynnik nakładania się R według Mandersa^5,6 reprezentuje rzeczywisty stopień kolokalizacji, tj. liczbę pikseli, które kolokalizują się w porównaniu z całkowitą liczbą pikseli.
   3. Z drugiej strony, współczynnik kolokalizacji, My, opisuje udział fluorescencji ugrupowania liczniejszego (w tym przypadku α-aktyniny, koloru zielonego) do ugrupowania mniej obfitego (w tym przypadku bakterii, kolor czerwony), tj. liczby czerwonych pikseli, które nakładają się na zielone piksele, w porównaniu z całkowitą liczbą czerwonych pikseli.
   4. Współczynniki Mandersa mieszczą się w zakresie od 1 do 0, gdzie 1 oznacza wysoką kolokalizację, a 0 brak, ale można je wyrazić w procentach dla łatwiejszej interpretacji.
7. Eksport wartości statystyk do dokumentu Excel w celu prezentacji danych.

4. Reprezentatywne wyniki

Wewnątrzkomórkowa lokalizacja Neisseria meningitidis z ekspresją Opc i α-aktyniny

Konfokalne obrazowanie komórek śródbłonka mikronaczyniowego ludzkiego mózgu zakażonych Nm przez 3 i 8 godzin, jak opisano powyżej, wykazało kolokalizację α-aktyniny i Nm, które wydawały się być rzadsze w 3-godzinnych eksperymentach infekcji (nie pokazane) w porównaniu z kulturami zakażonymi przez 8 godzin (Rysunek 1 A-F). Wyraźną kolokalizację α-aktyniny z meningokokami wykazującymi ekspresję Opc obserwowano za każdym razem w >5 powtórzonych eksperymentach. Przeprowadzono analizę statystyczną kolokalizacji przy użyciu kilku obrazów konfokalnych w sposób opisany powyżej. Ogólnie rzecz biorąc, w HBMEC zakażonym meningokokami z ekspresją Opc uzyskano >25% nakładanie się pikseli zielonych (α-aktynina) i czerwonych (Nm) (Figura 2B, współczynnik nakładania się R). W przeciwieństwie do α-aktyniny, eksperymentów, w których przeprowadzano znakowanie zinternalizowanych bakterii i aktyny lub wimentyny, sporadycznie obserwowano kolokalizację z aktyną, ale z wimentyną było rzadkie (ryc. 2B).

Dane były również analizowane przy użyciu współczynnika My, który uwzględnia względną obfitość każdej cząstki. My jest miarą częstości występowania bardziej obfitego sygnału (w tym przypadku zielonego, α-aktyniny) za każdym razem, gdy występuje mniej obfity sygnał (w tym przypadku czerwony, bakterie). Pomiar ten pokazuje uderzający poziom występowania α-aktininy w pobliżu zinternalizowanych meningokoków (ryc. 2A i C).

Rysunek 1. Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa do oceny interakcji wewnątrzkomórkowych N. meningitidis z α-aktyniną. A-H. Zlewające się monowarstwy śródbłonka wyhodowane na szkiełkach nakrywkowych zostały zakażone N. meningitidis wykazującymi ekspresję OPC (A-F). Po 8 godzinach nieprzylegające bakterie zostały zmyte, komórki utrwalono za pomocą paraformaldehydu i przesiąknięto 0,1% Tritonem X-100. Następnie bakterie i α-aktynina zostały zabarwione zgodnie z powyższym opisem (α-aktynina, kolor zielony; bakterie, kolor czerwony).

A-C. Jedno pole pokazuje obrazy x-y lokalizacji Nm (A) lub α-aktyniny (B). Obraz nakładki w (C) wskazuje kilka obszarów, w których pojawia się żółto-pomarańczowy kolor sugerujący kolokalizację. Strzałki w (A) i (B) pokazują obszary, w których wydaje się, że wokół bakterii wystąpił wysoki stopień akumulacji α-aktyniny.

D. Optyczne rozwarstwienie zakażonej monowarstwy HBMEC wskazujące na kolokalizację wokół wewnątrzkomórkowych bakterii znajdujących się u podstawy komórki.

Ponownie, ta kolokalizacja nie jest spowodowana przypadkowym sąsiedztwem α-aktininy, ponieważ ogólne zabarwienie α-aktyniny w tym regionie jest niskie.

E i F. Trójwymiarowe obrazy zainfekowanych monowarstw HBMEC przetworzone jak wyżej. Ukośny widok powierzchni wierzchołkowej (E) pokazuje przylegające bakterie zabarwione na czerwono (czerwona strzałka), podczas gdy kilka bakterii znajdujących się w kierunku podstawowych powierzchni komórek śródbłonka (żółta strzałka) ma wyraźnie pomarańczowy / żółty kolor. Położenie podstawowe można wyraźniej zobaczyć w (F), który jest przekrojem końcowym X-Z.

G. Ujemnie zabarwiony obraz z mikroskopu elektronowego N. meningitidis pokazujący jego dominujący diplococcal z. Każdy ziarniak ma średnicę około 0,5 μm.

Rysunek 2. Lokalizacja i dystrybucja α-aktyniny, aktyny i wimentyny w komórkach HBMEC.

A. Zainfekowane monowarstwy HBMEC były traktowane zgodnie z opisem w legendzie powyżej, ale oprócz α-aktyniny, niektóre szkiełka nakrywkowe były używane do wykrywania aktyny lub wimentyny za pomocą procedury podobnej do tej dla α-aktyniny. Jak wyżej, α-aktynina koncentrowała się wokół kilku zinternalizowanych bakterii (białe strzałki). Wimentyna i aktyna nie kolokowały się z bakteriami w znacznych ilościach. Pręt reprezentuje 20 μm.

B. & C. Wartości współczynników R i My uzyskano z więcej niż trzech eksperymentów przy użyciu oprogramowania Volocity, jak opisano powyżej.

Discussion

Możliwość wiązania zinternalizowanej Neisseria meningitidis wykazującej ekspresję OPC z α-aktyniną zbadano za pomocą HBMEC poprzez badanie kolokalizacji bakterii i białka cytoszkieletu w zakażonych komórkach po 3 i 8 godzinach inkubacji. Za pomocą mikroskopii konfokalnej można wykazać kolokalizację Neisseria meningitidis z α-aktyniną. Warto zauważyć, że chociaż bakterie zostały zinternalizowane po 3 godzinach, w tym momencie kolokalizacja z α-aktyniną była niewielka. Związek bakterii z białkiem cytoszkieletu wydawał się wymagać dłuższego okresu przebywania wewnątrzkomórkowego, ponieważ po 8-godzinnym okresie infekcji znaczna liczba bakterii miała α-aktyninę, najwyraźniej w bliskim związku. Alfa-aktynina jest białkiem wielofunkcyjnym, a interakcje bakterii z elementem cytoszkieletu mogą mieć znaczący wpływ na funkcję komórki docelowej, która jest przedmiotem obecnych badań.

Kwantyfikacja kolokalizacji, jak opisano powyżej, wymaga skrupulatnego przygotowania próbki. Szczególną uwagę należy zwrócić na utrwalanie próbki, okres blokowania i rozcieńczanie przeciwciał. Aby uzyskać najlepszy stosunek sygnału do szumu, każde przeciwciało pierwszorzędowe i drugorzędowe powinno być miareczkowane we wstępnych doświadczeniach w celu określenia optymalnych stężeń. Z naszego doświadczenia wynika, że nośnik montażowy Mowiol dawał lepsze obrazy.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Płytka 12-dołkowa	Corning	BC311
Szklane szkiełka nakrywkowe	VWR international	631-0152
BHI AGAR	LAB M	LAB048
M199	Sigma-Aldrich	M2154
RPMI 1640	Lonza Inc.	BE12-167E
MEM Aminokwasy endogenne	Sigma-Aldrich	M7145
HANK' S zbilansowany roztwór soli	Sigma-Aldrich	H9269
FBS	BioWhittaker	DE14-801F
Glutamina	Sigma-Aldrich	G7513
Pirogronian sodu	Sigma-Aldrich	S8636
Penicylina-Streptomycyna	Sigma-Aldrich	P0781
MEM Roztwór witaminowy	Sigma-Aldrich	M6895
PBSB	Lonza Inc.	BE17-513F
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Paraformaldehyd	Fisher Scientific	P/0840/53
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
DAPI	Sigma-Aldrich	D-9564
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
Mowiol 4-88	Calbiochem
Anty‑ Surowica przeciw Nm	Laboratoryjnie hodowana		Surowica królicza
TRITC anty-królicza Ig	Sigma-Aldrich	T6778
Anti α ‑ aktynina mAb [7H6]	Abcam	Ab32816	IgG
Anty aktyna mAb	Sigma-Aldrich	A4700	IgG2a
Anty wimentyna mAb	Sigma-Aldrich	V6630	IgG1
ALEXA FLUOR 488 anty‑ mysz IgG	Invitrogen	A11001
FITC anty-mysie IgG	Sigma-Aldrich	F-2012
1. Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa (CLSM): System obrazowania konfokalnego Leica SP5: Ten system, wykorzystując kombinację AOTF (akustyczno-optyczny filtr dostrajalny) i AOBS (akustyczno-optyczny rozdzielacz wiązki), upraszcza wzbudzenie przy określonych długościach fal. 2-Oprogramowanie: Oprogramowanie konfokalne Leica LCS, Leica Microsystems, Niemcy. Volocity 5, Improvision, PerkinElmer, USA.