Wizualizacja i kwantyfikacja oddziaływań wewnątrzkomórkowych Neisseria meningitidis oraz ludzkiej α-aktyniny za pomocą obrazowania konfokalnego

Podsumowanie

Neisseria meningitidis (Nm), gram-ujemny patogen dróg oddechowych specyficzny dla ludzi, może wiązać się z ludzką α-aktyniną. Przedstawiamy tutaj protokół wizualizacji kolokalizacji bakterii z wewnątrzkomórkową α-aktyniną po wniknięciu bakterii do ludzkich komórek śródbłonka mikro naczyniowego mózgu (HBMECs).

Streszczenie

Białko Opc bakterii Neisseria meningitidis (Nm, meningokoki) jest integralnym białkiem błony zewnętrznej eksponowanym na powierzchni, które może pełnić funkcję adhezyny i skutecznej inwazyny dla ludzkich komórek nabłonkowych i śródbłonka. Zidentyfikowaliśmy zlokalizowane na powierzchni śródbłonka integryny jako główne receptory dla Opc; proces ten wymaga, aby Opc najpierw związało się z ligandami integryn, takimi jak witronektyna, a za ich pośrednictwem z receptorami eksponowanymi przez komórkę¹. Proces ten prowadzi do inwazji bakteryjnej do komórek śródbłonka². Niedawno zaobserwowaliśmy interakcję Opc z białkiem o masie 100kDa znalezionym w lizatach całych ludzkich komórek³. Interakcję tę zauważyliśmy początkowo, gdy białka komórek gospodarza rozdzielone elektroforezą i przeniesione na nitrocelulozę poddano inkubacji z Nm eksponującym Opc. Interakcja była bezpośrednia i nie wymagała udziału cząsteczek pośredniczących. Za pomocą spektrometrii mas ustaliliśmy tożsamość tego białka jako α-aktynina. Ponieważ nie stwierdzono obecności α-aktyniny na powierzchni żadnej z ośmiu badanych linii komórkowych, a interakcje Opc z komórkami śródbłonka w obecności surowicy prowadzą do wniknięcia bakterii do komórek docelowych, zbadaliśmy możliwość wewnątrzkomórkowej interakcji tych dwóch białek. W tym celu hodowlane ludzkie komórki śródbłonka mikro naczyniowego mózgu (HBMECs) zainfekowano Nm eksponującym Opc przez dłuższy czas, a następnie za pomocą mikroskopii konfokalnej badano lokalizację zinternalizowanych bakterii oraz α-aktyniny. Zaobserwowaliśmy zależny od czasu wzrost kolokalizacji Nm z białkiem cytoszkieletowym, który był znaczący po ośmiogodzinnym okresie internalizacji bakterii. Ponadto zastosowanie oprogramowania do obrazowania ilościowego pozwoliło nam uzyskać względną miarę kolokalizacji Nm z α-aktyniną oraz innymi białkami cytoszkieletu. Przedstawiamy tutaj protokół wizualizacji i kwantyfikacji kolokalizacji bakterii z białkami wewnątrzkomórkowymi po wniknięciu bakterii do ludzkich komórek śródbłonka, choć procedura ta ma zastosowanie również do ludzkich komórek nabłonkowych.

Protokół

1. Protokół immunofluorescencji

Wysiewanie, zakażanie i immunobarwienie

Następujące procedury wymagają odpowiedniego poziomu bezpieczeństwa w laboratoriach hodowli tkankowych i mikrobiologicznych.

DZIEŃ 1

A. Przygotowanie komórek docelowych do infekcji

1. Wysiać HBMEC do uzyskania 50% konfluencji (~1,5x10⁴ komórek/cm²) na szkiełkach nakrywkowych (średnica 16 mm) umieszczonych w płytce 12-dołkowej (3,8 cm² obszar wzrostu/dołek).
   
   Pożywka wzrostowa: RPMI 1640 uzupełniona o 15% inaktywowanego ciepłem (56 °C, 30 min) FBS, 2 mM glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 100 J/ml penicyliny/streptomycyny, 1% (v/v) roztworu nieistotnych aminokwasów MEM oraz 1% roztworu witamin MEM.
2. Inkubować przez noc (O/N) w temperaturze 37°C, w 5% CO2₂ inkubator

B. Hodowla bakteryjna

1. Hodować wybrany szczep przez noc (16-18 h) na odpowiedniej pożywce, np. płytkach z agarem Brain Heart Infusion (BHI) uzupełnionym o 10% podgrzewanej krwi koni w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO₂⁴.

DZIEŃ 2

A. Przygotowanie zawiesiny bakteryjnej (N. meningitidis)

1. Za pomocą pętli do posiewu 10 μL przygotować zawiesinę nocnej hodowli bakterii w 2 mL PBSB (PBS z jonami wapnia i magnezu).
2. Pozostawić zawiesinę na 5 min w temperaturze pokojowej (RT), aby umożliwić osadzenie się dużych agregatów bakteryjnych.
3. Bez naruszania osadu przenieść górną 1 mL zawiesiny (szczep macierzysty) do sterylnej probówki.
4. Aby oszacować liczbę bakterii w szczepie macierzystym, dodać alikwoty (20-50 μL) do probówek zawierających 1 mL 1% SDS w 0,1M NaOH i delikatnie wymieszać w celu solubilizacji.
5. Zmierzyć zawartość kwasów nukleinowych w roztworze, określając absorbancję przy 260 nm (A260). W naszych warunkach A260 równa 1 odpowiada 5x10⁸ jednostkom tworzącym kolonie na ml (cfu/mL). Można to zweryfikować, przygotowując szereg rozcieńczeń szczepu macierzystego w PBSB, wysiewając je na płytki agarowe i licząc kolonie po inkubacji przez noc (O/N).
6. Rozcieńczyć alikwot szczepu macierzystego w medium infekcyjnym [M199 uzupełniony o 2% zdekomplementowaną (56°C, 30 min) normalną ludzką surowicę (NHS)], aby uzyskać wymaganą gęstość bakterii do infekcji komórek docelowych.
   1. W naszym laboratorium rutynowo stosuje się stosunek infekcji wynoszący 200-300 bakterii na jedną komórkę docelową.

B. Infekcja hodowli komórkowych

1. Przemyj 3 razy szkiełka podstawowe z hodowanymi komórkami docelowymi za pomocą pożywki Hanksa, aby usunąć wszelkie ślady antybiotyków.
2. Zainfekuj komórki świeżo przygotowanymi zawiesinami bakteryjnymi (opisanymi powyżej), inkubując przez 3 h do 8 h w temperaturze 37°C, w 5%CO₂.
3. Po zakończeniu okresu infekcji przemyj komórki trzykrotnie PBS i utrwal w 500 μL 2% paraformaldehydu (PFA) przez 30-45 min w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4°C.
   1. Ustalono, że utrwalanie paraformaldehydem w powyższym stężeniu i czasie jest odpowiednie do zachowania morfologii bakterii i komórek.
4. Po wypłukaniu paraformaldehydu przeprowadź permeabilizację utrwalonych komórek poprzez inkubację w 0,1% Triton X-100 rozpuszczonym w PBS przez 10 min.
5. Przemyj próbki 3 razy PBS.
6. Przystąp do immunobarwienia lub alternatywnie pozostaw próbki w 500 μL 1%BSA/PBST przez noc w 4°C.

DZIEŃ 3

Immunobarwienie

Barwienie bakterii wewnątrzkomórkowych oraz α-aktyniny można przeprowadzić sekwencyjnie lub jednocześnie, stosując odpowiednie przeciwciała pierwotne i wtórne w następujący sposób; wszystkie procedury można wykonać w płytkach 12-dołkowych.

1. Zablokować szkiełka podstawowe zawierające permeabilizowane komórki za pomocą 500 μL 3% BSA/PBST (PBS zawierający 0,05% Triton X-100) przez 30-60 min w RT
2. Po przemyciu PBS przenieść każde szkiełko do nowej suchej studzienki w płytce 12-dołkowej.
3. Dodać przeciwciała pierwszorzędowe przeciwko bakteriom i α-actininie; 80 do 100 μL przeciwciała na szkiełko jest wystarczające, jeśli zostanie dodane ostrożnie tak, aby pokryło powierzchnię szkiełka. Inkubować przez 1h w temperaturze pokojowej.
   1. Użyto jednocześnie króliczego poliklonalnego antyserum przeciwko Neisseria meningitidis (hodowane laboratoryjnie) oraz mysiego przeciwciała monoklonalnego (mAb) przeciwko α-actininie (Abcam). W niektórych eksperymentach, zamiast przeciwciał anty-α-actinin, zastosowano mAb przeciwko aktynie lub wimentynie (Sigma).
4. Po zakończeniu inkubacji dodać do studzienki 200 μL PBS, podnieść szkiełko i umieścić je w nowej studni zawierającej 500 μL PBS.
5. Po 5 min usunąć PBS za pomocą pipety, a następnie dodać świeży PBS. Powtórzyć dwukrotnie. Przenieść szkiełka do nowej suchej studzienki.
6. Dodać odpowiednie przeciwciała drugorzędowe sprzężone z różnymi fluorochromami, rozcieńczone w 1% BSA/PBST; inkubować w RT przez 1h w ciemności.
   1. Do detekcji bakterii użyto przeciwciał anty-króliczych Ig sprzężonych z TRITC, a do detekcji α-actinin i innych białek cytoszkieletu użyto przeciwciał anty-mysich Ig sprzężonych z FITC (Sigma) lub Alexa Fluor 488 (Invitrogen).
7. Po zakończeniu inkubacji przemyć zgodnie z krokami 4 i 5.
8. Przeprowadzić barwienie kontrastowe za pomocą 0,6 μg/mL DAPI w PBS (barwnik DNA) przez 5 min w RT w ciemności.
9. Przepłukać PBS.
10. Zamontować szkiełka podstawowe (komórkami skierowanymi w dół) na preparatach za pomocą kropli medium montażowego (np. Mowiol lub Vectashield).
11. Przechowywać w ciemności w temperaturze 4°C.
12. Próbki są gotowe do obserwacji pod mikroskopem.

2. Konfokalna mikroskopia skaningowa (CLSM)

Aby zaobserwować i zarejestrować obrazy bakterii wewnątrzkomórkowych oraz elementów cytoszkieletu, wykorzystano próbki poddane immunoznakowaniu, a obrazy wykonano przy użyciu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego Leica SP5-AOBS sprzężonego z odwróconym mikroskopem epifluorescencyjnym Leica DM I6000. Wszystkie obrazy pozyskano z użyciem obiektywu imersyjnego olejowego 63x NA 1.4 i przetworzono za pomocą oprogramowania Leica.

Procedura CLSM:

1. Aby rozpocząć procedurę CLSM, nanieść kroplę olejku imersyjnego na obiektyw i umieścić preparat na stole mikroskopu stroną z szkiełkiem nakrywkowym do dołu.
2. Ustawić mikroskop w trybie wizualnym i zlokalizować obszar zainteresowania, korzystając z okularów mikroskopu.
3. W oprogramowaniu Leica wybrać tryb akwizycji xyz.
4. Wybrać format 512 x 512 (rozmiar ramki). W badaniach kolokalizacji im wyższa rozdzielczość, tym dokładniejszy obraz, przy czym należy pamiętać o granicy rozdzielczości mikroskopu. Następnie wybrać dwukierunkowy tryb X, co zwiększy prędkość skanowania i pomoże ograniczyć fotowyblakanie.
5. Skonfigurować ustawienia skanowania sekwencyjnego. Kliknąć funkcję „seq” i wybrać jeden z trybów skanowania. Stosujemy tryb „between lines”.
6. Wybrać wiązki laserowe zgodnie z fluorochromami sprzężonymi z przeciwciałami wtórnymi: 405 nm dla DAPI (niebieski), 488 nm dla Alexa Fluor 488 (zielony) oraz 561 nm dla TRITC (czerwony). Aktywować odpowiednio fotopowielacz (PMT) 1, 2 i 3. Dostosować ustawienia PMT, aby wykryć prawidłową długość fali emisji.
7. Ustawić górną („begin”) i dolną („end”) granicę stosów z lub serii. Następnie określić wymaganą „wielkość kroku z”.
   1. Neisseria meningitidis jest diplokokiem (Rysunek 1G) i ponieważ każdy kok ma przybliżoną średnicę 0.5 μm, wybrano wielkość kroku z wynoszącą 0.20 μm, aby zwiększyć prawdopodobieństwo zeskanowania każdego kokka co najmniej dwukrotnie. Wartość ta mieści się również w zakresie wielkości kroku dla optymalnej rozdzielczości 0.1 - 0.2 μm.
8. Ustawić końcowe parametry skanowania, wybierając uśrednianie linii (line averaging) równe 3, aby poprawić stosunek sygnału do szumu.
9. Po kliknięciu „start” uzyskiwane są obrazy barwione podwójnie lub potrójnie poprzez sekwencyjne skanowanie przy różnych długościach fal, co pozwala wyeliminować interferencje (cross-talk) między różnymi chromoforami.
10. Aby wskazać kolokalizację dwóch fluorochromów, wybrać funkcję „overlay”, aby połączyć wybrane kanały w jeden obraz; na przykład, gdy fluorochromy Alexa 488 (zielony) i TRITC (czerwony) kolokalizują, na obrazie nałożonym pojawi się kolor żółty.
11. Skompilować stosy z lub serie za pomocą funkcji „maximum projection” w celu stworzenia obrazu 2D niezbędnego do wizualizacji ewentualnej kolokalizacji. Bardziej szczegółową analizę kolokalizacji można uzyskać poprzez analizę każdego przekroju optycznego.
12. Po uzyskaniu stosów z lub serii, przetworzyć dane w celu otrzymania obrazu ortogonalnego do wizualizacji wewnątrzkomórkowej lokalizacji różnych elementów (Rysunek 1E).

3. Kwantyfikacja kolokalizacji

Analizy statystyczne obrazów z konfokalnego mikroskopu skaningowego są przeprowadzane przy użyciu oprogramowania Volocity (Improvision, PerkinElmer). Oprogramowanie to oferuje narzędzie zaprojektowane specjalnie do analizy kolokalizacji zgodnie z opisem Manders et al.(1993)⁵. Kolokalizacja w kontekście cyfrowego obrazowania fluorescencyjnego może być opisana jako detekcja sygnału w tym samym voxelu (objętości piksela) w każdym kanale. Dwa kanały składają się z obrazów dwóch różnych fluorochromów pobranych z tego samego obszaru próbki (podręcznik użytkownika Volocity). Analizy statystyczne wykonuje się w oprogramowaniu Volocity (Improvision, PerkinElmer), stosując opisaną poniżej ilościową analizę kolokalizacji.

Ilościowa analiza kolokalizacji

1. Utwórz bibliotekę obrazów CLSM za pomocą oprogramowania Volocity.
2. Z górnego paska w menu obrazu wybierz opcję „extended focus”. Narzędzie to złączy stosy z (z-stacks) w obraz 2D do analizy.
3. Wybierz narzędzie „Colocalization”. Dwa analizowane kanały powinny mieć taką samą głębię kolorów.
4. Zaznacz obszar, który ma zostać poddany kwantyfikacji. Ustaw próg (threshold), aby usunąć tło.
5. Wygeneruj wyniki kolokalizacji, wybierając opcję „generate colocalization”. Statystyki kolokalizacji zostaną wygenerowane dla wcześniej wybranych obszarów zainteresowania (ROI).
6. Wybierz współczynniki Mandersa R (współczynnik nakładania) oraz My (współczynnik kolokalizacji).
   1. Współczynniki Mandersa nie są wrażliwe na intensywność barwienia, ponieważ są normalizowane względem całkowitej intensywności pikseli; mogą zatem być stosowane, gdy barwienie jednego antygenu jest silniejsze od drugiego.
   2. Współczynnik nakładania R według Mandersa^5,6 reprezentuje rzeczywiste stopień kolokalizacji, tzn. liczbę pikseli kolokalizujących w stosunku do całkowitej liczby pikseli.
   3. Z kolei współczynnik kolokalizacji My opisuje wkład fluorescencyjny składnika występującego w większej ilości (w tym przypadku α-actinin, zielony) w stosunku do składnika występującego w mniejszej ilości (w tym przypadku bakterie, czerwony), tzn. liczbę czerwonych pikseli nakładających się na zielone piksele w stosunku do całkowitej liczby czerwonych pikseli.
   4. Współczynniki Mandersa mieszczą się w zakresie od 0 do 1, gdzie 1 oznacza wysoką kolokalizację, a 0 jej brak; dla łatwiejszej interpretacji mogą być one wyrażone w procentach.
7. Wyeksportuj wartości statystyczne do dokumentu Excel w celu prezentacji danych.

4. Reprezentatywne wyniki

Lokalizacja wewnątrzkomórkowa Neisseria meningitidis wykazującej ekspresję Opc oraz α-aktyniny

Obrazowanie konfokalne ludzkich mikro naczyniowych komórek śródbłonka mózgu zainfekowanych Nm przez 3 i 8 godzin, przeprowadzone zgodnie z powyższym opisem, wykazało kolokalizację α-aktyniny i Nm, która wydawała się występować rzadziej w eksperymentach z 3-godzinną infekcją (nie pokazano) w porównaniu z kulturami zainfekowanymi przez 8 h (Rysunek 1 A-F). Wyraźna kolokalizacja α-aktyniny z meningokokami wykazującymi ekspresję Opc była obserwowana za każdym razem w >5 powtórzonych eksperymentach. Analiza statystyczna kolokalizacji z wykorzystaniem kilku obrazów konfokalnych została przeprowadzona zgodnie z powyższym opisem. Ogółem, w HBMEC zainfekowanych meningokokami wykazującymi ekspresję Opc, uzyskano >25% nakładania się zielonych (α-aktynina) i czerwonych (Nm) pikseli (Rysunek 2B, współczynnik nakładania R). W przeciwieństwie do α-aktyniny, w eksperymentach, w których przeprowadzono znakowanie zinternalizowanych bakterii oraz aktyny lub wimentyny, zaobserwowano sporadyczną kolokalizację z aktyną, natomiast kolokalizacja z wimentyną była rzadka (Rysunek 2B).

Dane przeanalizowano również z wykorzystaniem współczynnika My, który uwzględnia względną liczebność każdej z części. My jest miarą częstotliwości występowania sygnału o większej liczebności (w tym przypadku zielonego, α-aktyniny) za każdym razem, gdy pojawia się sygnał o mniejszej liczebności (w tym przypadku czerwony, bakterie). Miara ta wykazuje uderzający poziom występowania α-aktyniny w sąsiedztwie zinternalizowanych meningokoków (Rysunek 2A i C).

Rysunek 1. Konfokalna skaningowa mikroskopia laserowa do oceny wewnątrzkomórkowych interakcji N. meningitidis z α-aktyniną. A-H. Konfluencyjne monowarstwy śródbłonka hodowane na szkiełkach przedmiotowych zainfekowano szczepem N. meningitidis wykazującym ekspresję białka Opc (A-F). Po 8 h wypłukano bakterie nieprzylegające, komórki utrwalono paraformaldehydem i permeabilizowano 0,1% Tritonem X-100. Następnie bakterie i α-aktyninę barwiono zgodnie z opisem powyżej (α-aktynina, kolor zielony; bakterie, kolor czerwony).

A-C. Jedno pole widzenia przedstawiające obrazy x-y lokalizacji Nm (A) lub α-aktyniny (B). Obraz nałożony w (C) wskazuje kilka obszarów, w których pojawia się kolor żółto-pomarańczowy, co sugeruje kolokalizację. Strzałki w (A) i (B) pokazują obszary, w których prawdopodobnie nastąpiła wysoka akumulacja α-aktyniny wokół bakterii.

D. Sekcja optyczna zainfekowanej monowarstwy HBMEC wskazująca na kolokalizację wokół bakterii wewnątrzkomórkowych zlokalizowanych u podstawy komórki.

Ponownie, kolokalizacja ta nie wynika z przypadkowej bliskości α-aktyniny, ponieważ ogólne barwienie α-aktyniny w tym obszarze jest słabe.

E i F. Trójwymiarowe obrazy zainfekowanych monowarstw HBMEC przetworzonych w opisany wyżej sposób. Widok pod kątem powierzchni apikalnej (E) pokazuje przylegające bakterie zabarwione na czerwono (czerwona strzałka), podczas gdy kilka bakterii zlokalizowanych w kierunku powierzchni bazalnych komórek śródbłonka (żółta strzałka) ma wyraźny kolor pomarańczowo-żółty. Lokalizacja bazalna jest widoczna wyraźniej na obrazie (F), który stanowi przekrój poprzeczny X-Z widok z końcówki.

G. Obraz z mikroskopu elektronowego N. meningitidis po barwieniu negatywowym, przedstawiający jego przeważającą postać diplokokową. Każdy kok każdy kok ma średnicę około 0,5 μm.

Rysunek 2. Lokalizacja i rozkład α-actinin, actin oraz vimentin w komórkach HBMEC.

A. Zainfekowane monowarstwy HBMEC traktowano zgodnie z opisem w powyższej legendzie, jednak oprócz α-aktyniny, niektóre szkiełka podstawowe wykorzystano do wykrywania aktyny lub wimentyny w procedurze podobnej do tej zastosowanej dla α-aktyniny. Jak wyżej, α-aktynina skoncentrowała się wokół kilku zinternalizowanych bakterii (białe strzałki). Wimentyna i aktyna nie kolokalizowały z bakteriami w zauważalnym stopniu. Pasek reprezentuje 20 μm.

B. i C. Wartości współczynników R oraz My uzyskano w ponad trzech eksperymentach z wykorzystaniem oprogramowania Volocity zgodnie z powyższym opisem.

Dyskusja

Możliwość wiązania wewnątrzkomórkowych Neisseria meningitidis wykazujących ekspresję Opc z α-aktyniną zbadano z wykorzystaniem HBMEC, analizując kolokalizację bakterii i białka cytoszkieletowego w zainfekowanych komórkach po 3 i 8 h inkubacji. Za pomocą mikroskopii konfokalnej wykazano kolokalizację Neisseria meningitidis z α-aktyniną. Warto zauważyć, że choć bakterie zostały wchłonięte do wnętrza komórek w 3 h, w tym punkcie czasowym stwierdzono niewielką kolokalizację z α-aktyniną. Powiązanie bakterii z białkiem cytoszkieletowym wydawało się wymagać dłuższego okresu przebywania wewnątrzkomórkowego, ponieważ po 8 h infekcji znaczna liczba bakterii wykazywała ewidentne bliskie powiązanie z α-aktyniną. Alfa-aktynina jest białkiem wielofunkcyjnym i oddziaływania bakterii z tym elementem cytoszkieletu mogą mieć istotny wpływ na funkcję komórki docelowej, co jest przedmiotem aktualnych badań.

Ilościowe określenie kolokalizacji opisane powyżej wymaga starannego przygotowania preparatów. Szczególną uwagę należy zwrócić na fiksację preparatów, czas blokowania oraz rozcieńczenia przeciwciał. Aby uzyskać najlepszy stosunek sygnału do szumu, każde przeciwciało pierwszo- i drugorzędowe powinno zostać mianowane w eksperymentach wstępnych w celu ustalenia optymalnych stężeń. W naszym doświadczeniu medium montażowe Mowiol pozwoliło na uzyskanie lepszych obrazów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
płytka 12-dołkowa	Corning	BC311
Szkiełka nakrywkowe	VWR International	631-0152
AGAR BHI	LAB M	LAB048
M199	Sigma-Aldrich	M2154
RPMI 1640	Lonza Inc.	BE12-167E
MEM Niezbędne Aminokwasy Nieessentialne	Sigma-Aldrich	M7145
HANK’zrównoważony roztwór soli S	Sigma-Aldrich	H9269
FBS	BioWhittaker	DE14-801F
Glutamina	Sigma-Aldrich	G7513
Kwas pirogronowy sodu	Sigma-Aldrich	S8636
Penicylina-Streptomycyna	Sigma-Aldrich	P0781
Roztwór witamin MEM	Sigma-Aldrich	M6895
PBSB	Lonza Inc.	BE17-513F
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Paraformaldehyd	Fisher Scientific	P/0840/53
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
DAPI	Sigma-Aldrich	D-9564
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
Mowiol 4-88	Calbiochem	475904
Przeciwciało‑anty-Nm serum	Hodowlane		Surowica królika
TRITC przeciwciało przeciwko Ig królika	Sigma-Aldrich	T6778
Przeciwciała α‑przeciwciało monoklonalne (mAb) przeciwko aktyninie [7H6]	Abcam	Ab32816	IgG
przeciwciało monoklonalne przeciwko aktynie	Sigma-Aldrich	A4700	IgG2a
Przeciwciało monoklonalne anty-wimentyna	Sigma-Aldrich	V6630	IgG1
ALEXA FLUOR 488 przeciwciało‑mysie IgG	Invitrogen	A11001
FITC przeciwko mysiej IgG	Sigma-Aldrich	F-2012
1. Konfokalna mikroskopia skaningowa (CLSM): System obrazowania konfokalnego Leica SP5: system ten, dzięki zastosowaniu kombinacji AOTF (akustooptycznego filtra strojonego) oraz AOBS (akustooptycznego dzielnika wiązki), upraszcza wzbudzanie przy użyciu specyficznych długości fal. 2-Oprogramowanie: Oprogramowanie do mikroskopii konfokalnej Leica LCS, Leica Microsystems, Niemcy. Volocity 5, Improvision, PerkinElmer, USA.