Opisano szybką metodę pozwalającą na poznanie struktury polisacharydów w macierzy zewnątrzkomórkowej. Metoda ta wykorzystuje specyficzność glikozylohydrolaz oraz czułość spektrometrii mas, co umożliwia analizę niewielkich ilości materiału. Technikę tę można dostosować do bezpośredniego zastosowania w tkance.
Artykuł metodologiczny
Profilowanie masy oligosacharydów (OLIMP) wielocukrów zewnątrzkomórkowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Bezpośredni kontakt komórek z otoczeniem jest u wielu organizmów pośredniczony przez macierz zewnątrzkomórkową. Wspólną cechą macierzy zewnątrzkomórkowych jest obecność złożonych reszt cukrowych w postaci glikoprotein, proteoglikanów i/lub polisacharydów. Przykłady obejmują macierz zewnątrzkomórkową ludzi i komórek zwierzęcych, składającą się głównie z białek włóknistych i proteoglikanów, polisacharydowe ściany komórkowe roślin i grzybów oraz ściany komórkowe bakterii oparte na proteoglikanach i glikolipidach. Wszystkie te glikostruktury odgrywają kluczową rolę w komunikacji i sygnalizacji międzykomórkowej oraz między komórką a środowiskiem.
Niezwykle złożonym przykładem macierzy zewnątrzkomórkowej są ściany komórek roślin wyższych. Składają się one niemal w całości z cukrów, które stanowią do 75% masy suchej, i obejmują najliczniejsze biopolimery występujące na naszej planecie. W związku z tym prowadzone są badania nad tym, jak najlepiej wykorzystać te materiały jako neutralne pod względem emisji węgla odnawialne zasoby w celu zastąpienia petrochemikaliów pochodnych z paliw kopalnych. Głównym wyzwaniem w procesie konwersji do paliw pozostaje oporność ścian na degradację enzymatyczną lub chemiczną, wynikająca z unikalnych glikostruktur obecnych w tym wyjątkowym biokompozycie.
W niniejszej pracy przedstawiamy metodę szybkiej i czułej analizy glikostruktur ścian komórkowych roślin. Metoda ta, nazwana OLIgo Mass Profiling (OLIMP), opiera się na enzymatycznym uwalnianiu oligosacharydów z materiałów ściennych z wykorzystaniem specyficznych glikozylohydrolaz oraz późniejszej analizie rozpuszczonych mieszanin oligosacharydów za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą macierzą i analizą czasu przelotu (MALDI-TOF/MS)1 (Rysunek 1). OLIMP wymaga ścian zaledwie 5000 komórek do przeprowadzenia pełnej analizy, może być wykonywany bezpośrednio na tkance2 i nadaje się do analiz wysokoprzepustowych3. Chociaż za pomocą metody OLIMP nie można określić bezwzględnej ilości rozpuszczonych oligosacharydów, to na podstawie widm mas można określić względną obfitość różnych jonów oligosacharydów, co pozwala uzyskać informacje o wzorcu podstawienia natywnych polisacharydów obecnych w ścianie.
Metodę OLIMP można wykorzystać do analizy szerokiej gamy polimerów ścian komórkowych, ograniczonej jedynie dostępnością odpowiednich enzymów4. Przykładowo, do analizy polimerów obecnych w ścianie komórkowej roślin dostępne są enzymy pozwalające na analizę hemiceluloz: ksyloglukanu przy użyciu ksyloglukanazy5, 11, 12, 13, ksylanu przy użyciu endo-β-(1-4)-ksylanazy 6,7 lub polisacharydów pektynowych przy użyciu kombinacji poligalaktronazy i metyloesterazy 8. Co więcej, stosując te same zasady OLIMP, można monitorować i określać aktywności glikozylohydrolaz, a nawet glikozyltransferaz 9.
Protokół
Metoda OLIMP została zaprezentowana na przykładzie głównej hemicelulozy występującej w ścianach komórkowych roślin dwudzielnych, ksyloglukanu, z wykorzystaniem endoglukanazy jako glikozylohydrolazy. Metodę zademonstrowano z użyciem całych siewek Arabidopsis jako źródła tkanki roślinnej. W zależności od pożąganej analizy, przy zastosowaniu tej samej procedury, enzym oraz materiał macierzy zewnątrzkomórkowej można zastąpić innymi.
1. Izolacja ściany komórkowej
- Zabierz pięć 5-dniowych całych siewek Arabidopsis lub równoważną ilość pożądanego materiału i przenieś je do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5mL. Upewnij się, że materiał znajduje się na dnie probówki.
- Dodaj do probówki reakcyjnej dwie metalowe kulki o średnicy 3mm na wierzch próbki i zamroź błyskawicznie w ciekłym azocie.
- Rozetrzyj zamrożoną próbkę w młynku kulowym (2:30min, 25Hz).
- Dodaj do próbki 1mL 70% wodnego etanolu. Usuń metalowe kulki za pomocą magnesu. Dokładnie wymieszaj w wibratorze (vortex).
- Odwiruj próbkę przy 14 0rpm przez 10min, aby otrzymać osad z pozostałości nierozpuszczalnych w alkoholu zawierających materiał ścian komórkowych.
- Ostrożnie usuń nadsącz poprzez aspirację. Upewnij się, że nie naruszono osadu.
- Dodaj 1mL roztworu chloroformu/metanolu (1:1 v/v). Dokładnie wymieszaj wibratorze (vortex), aby resuspenderować osad.
- Odwiruj próbkę przy 14 0rpm przez 10min i ostrożnie usuń nadsącz poprzez aspirację. Upewnij się, że nie naruszono osadu.
- Osusz próbkę za pomocą koncentratora.
2. Solubilizacja oligosacharydów
- W celu solubilizacji konkretnego polisacharydu w postaci jego oligosacharydów, zawiesić suchy osad w 25μl odpowiedniego buforu. W przypadku endoglukanazy stosuje się 50mM mrzeczanu amonu, pH4.5. Dodać 0,2U endoglukanazy. Zawiesinę wymieszać wortexie, a następnie odwirować ciecz.
- Próbkę inkubować przez 16h w temperaturze 37°C w inkubatorze, przy wstrząsaniu z prędkością 30rpm.
- Usunąć rozpuszczalnik z hydrolizatu (wodę) za pomocą koncentratora.
3. Analiza MALDI-TOF uwolnionych oligosacharydów
- Kulki żywicy kationowymiennej BioRex MSZ 501 są używane do usuwania soli i enzymów z trawionej próbki. Przygotuj kulki, umieszczając porcję w pustej kolumnie i płucząc je obfite ilością wody.
- Dodaj 5-10 kulek BioRex do trawionej i wysuszonej próbki. Następnie dodaj 10μl wody; w przypadku mniejszych ilości materiału można użyć 5μl wody. Zanurz kulki w roztworze, krótko wirując probówkę. Inkubuj przez co najmniej 10min w temperaturze pokojowej.
- Nanieś 2μl matrycy (kwas 2,5-dihydroksybenzoowy (DHB), 10mg/ml w wodzie) na płytkę docelową MALDI. Odparuj rozpuszczalnik matrycy w próżni, aby uzyskać jednorodne kryształy chemiczne matrycy.
- Nanieś 2μl odsolonego roztworu próbki na kryształy matrycy na płytce docelowej.
W przypadku nanoszenia dużej liczby próbek, proces ten nie powinien trwać dłużej niż 3min. Taki przedział czasowy gwarantuje, że pierwsza naniesiona próbka nie wyschnie jeszcze całkowicie. Odczekaj dodatkowe 2min, aby zapewnić dokładne wymieszanie rozpuszczonej matrycy i cząsteczek oligosacharydów próbki w ostatnio naniesionej próbce. Następnie wysusz płytkę docelową w próżni.
Mieszanina próbka/matryca powinna skrystalizować się w czasie krótszym niż 1min, aby umożliwić jednorodną krystalizację. - Umieść płytkę docelową w spektrometrze mas MALDI-TOF. Urządzenie powinno być ustawione w trybie dodatniego reflektronu z napięciem przyspieszającym 200V i opóźnieniem 350 nm; wybrany zakres mas powinien wynosić 50-30 Da (może ulec zmianie w zależności od oczekiwanych oligomerów). Rozpocznij naświetlanie laserem i zbierz 10-20 widm na próbkę, które zostaną zestawione w celu wygenerowania reprezentacyjnego widma średniego (Rysunek 2A). Jony reprezentujące konkretne oligosacharydy można zidentyfikować na podstawie ich stosunku masy do ładunku (m/z). Intensywności jonów (wysokość piku) wszystkich interesujących jonów powinny zostać zsumowane do 100%, co pozwoli określić względną zawartość każdego oligosacharydu w próbce (Rysunek 2B).
4. Analiza in situ OLIMP
Metoda OLIMP może być stosowana również bezpośrednio na tkance, z pominięciem wszelkich etapów przygotowania ścian komórkowych. Jako przykład wykorzystano etiolizowane podkiełszacze Arabidopsis jako źródło tkanki roślinnej. Ponownie zastosowano endoglukanazę w celu określenia struktury hemiceluloz ksyloglukanowych. W zależności od pożągowanej analizy, przy zastosowaniu tej samej procedury, można zmienić enzym oraz materiał tkankowy.
- Zebrać etiolizowaną siewkę, umieścić ją na pustej płytce docelowej MALDI i pozostawić do wyschnięcia.
- Nanieść 0,5μl endoglukanazy (0,4U/μl, rozpuszczonej w 50mM formianie amonu, pH4,5) na wysuszoną siewkę w wybranym miejscu. Należy upewnić się, że kropla enzymu częściowo dotyka płytki docelowej.
- Umieścić płytkę docelową MALDI w zamkniętym pojemniku z nasyconą wilgotnością, aby zapobiec wysychaniu kropli enzymu. Inkubować płytkę w komorze przez 16h w temperaturze 37°C.
- Wysuszyć płytkę docelową MALDI z tkanką roślinną i kroplą enzymu w próżni.
- Nanieść 0,5μl matrycy (DHB; 10mg/l) na każdą wysuszoną plamkę enzymu. Pozostawić na 2min.
- Wysuszyć płytkę docelową MALDI w próżni.
- Przeanalizować próbki za pomocą MALDI-TOF. Umieścić płytkę docelową z tkanką i plamką(mi) enzymu/matrycy w spektrometrze mas MALDI-TOF. Urządzenie powinno być ustawione w dodatnim trybie reflektronowym z napięciem przyspieszającym 20V i opóźnieniem 350 nm; wybrany zakres mas powinien wynosić 50-30 Da (może ulec zmianie w zależności od oczekiwanych oligomerów).
- Zacząć naświetlać laserem kryształy matrycy/próbki OBOK tkanki. Należy upewnić się, że laser nie trafia w samą tkankę, ponieważ w takim przypadku czas przelotu cząsteczek będzie błędny. Zebrać około 20-50 widm z plamki, które zostaną zestawione w celu wygenerowania reprezentatywnego widma średniego (Rysunek 3). Jony reprezentujące konkretne oligosacharydy można zidentyfikować po ich stosunku masy do ładunku (m/z). Można podać intensywności jonów (wysokość piku), a wszystkie interesujące jony powinny zostać zsumowane do 100%, co pozwoli określić względną zawartość każdego oligosacharydu w próbce.
5. Reprezentatywne wyniki
Przykład analizy OLIMP hemiceluloz ksyloglukanowych występujących w siewkach Arabidopsis przedstawiono na rysunku 2. Dzięki różnicom w masach jonów oraz dobrze zcharakteryzowanej specyficzności enzymu (endoglukanazy), jony można przypisać do konkretnych struktur oligosacharydów (rysunek 2A). Oczywiście nie można odróżnić izomerów strukturalnych. Podstawowym założeniem dla oznaczenia względnej zawartości poszczególnych oligosacharydów (rysunek 2B) jest fakt, że ich współczynnik odpowiedzi w spektrometrii mas jest bardzo podobny dla tych oligosacharydów. Jak pokazano tutaj, ilościowe oznaczenie metodą OLIMP jest wysoce powtarzalne. Należy jednak pamiętać, że odporność metody jest w dużym stopniu zależna od stosunku sygnału do szumu dla poszczególnych jonów oligosacharydów. Na przykład zanieczyszczenie solami lub mniejsze ilości oligosacharydów mogą zmniejszyć ten stosunek.
Analiza OLIMP przeprowadzona bezpośrednio na tkance (analiza in situ) umożliwia badanie bardzo małych i precyzyjnie określonych obszarów oraz wymaga minimalnego przygotowania próbek. W przedstawionym tutaj przykładzie (Rysunek 3) nie zaobserwowano różnic jakościowych (te same jony), lecz ilościowe (zróżnicowanie intensywności jonów) pomiędzy tkanką pędu i korzenia siewki Arabidopsis. Zatem modyfikacje metody OLIMP mogłyby prowadzić do uzyskania „obrazowania” tkanek.
Rysunek 1. Schemat procedury OLIMP z wykorzystaniem całości Arabidopsis siewki jako źródło roślinne. Najpierw tkankę maceruje się i przygotowuje materiał ze ścian komórkowych (rysunek zmodyfikowany na podstawie Fujino et al.10Następnie, przy użyciu specyficznej hydrolazy, uwalniane są oligosacharydy konkretnego polisacharydu ścian komórkowych. Na koniec, za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF, wyznaczana jest względna zawartość rozpuszczalnych oligosacharydów.
Rycina 2. Względna zawartość oligosacharydów ksyloglukanu w etiolizowanych siewkach z Arabidopsis wyznaczone za pomocą OLIMP. A) Reprezentatywne widmo masy oligosacharydów ksyloglukanu; każdy jon reprezentuje konkretną strukturę oligosacharydu, izomerów strukturalnych nie można rozróżnić. B) Odpowiadający temu wykres słupkowy służący do oznaczenia względnej zawartości oligosacharydów.
Rycina 3. In situ Analiza OLIMP z wykorzystaniem etiolizowanych siewek Arabidopsis jako przykład. Każda kropla z enzymem/trawieniem (kolorowe okręgi) może być analizowana niezależnie, a odpowiadające jej widma mas mogą zostać uzyskane i przeanalizowane.
Rysunek 4. Widmo OLIMP hemicelulozowego ksylanu otrzymanego w wyniku trawienia materiału z liści Miscanthusu ksylanazą (Megazyme).
Dyskusja
Przedstawiona tutaj metoda OLIMP umożliwia bardzo czułą i szybką analizę polimerów obecnych w macierzach zewnątrzkomórkowych. OLIMP łączy enzymatyczne uwalnianie oligomerów z późniejszą analizą MALDI-TOF. Generowanie widma MALDI-TOF trwa mniej niż minutę, dzięki czemu OLIMP nadaje się do szerokiego zakresu zastosowań, w tym do badań wysokoprzepustowych, takich jak skryning mutantów. OLIMP nie ogranicza się do polisacharydów roślinnych i potencjalnie może być stosowany do szerokiej gamy polimerów, będąc ograniczonym jedynie dostępnością specyficznych enzymów hydrolitycznych. Ograniczeniem metody OLIMP jest jednak fakt, że nie można za jej pomocą uzyskać bezwzględnej ilości polimeru.
Jak wspomniano wcześniej, metoda OLIMP może być wykorzystywana do badania struktury różnorodnych polisacharydów obecnych w macierzy zewnątrzkomórkowej wielu gatunków. Przykładowo, rycina 4 przedstawia widmo OLIMP głównego hemicelulozy występującej u traw – ksylanu. W tym przypadku materiał ścian komórkowych pochodzący z umiarkowanego gatunku traw Miscanthus został poddany trawieniu ksylanazą.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była finansowana z grantu OO0G01 Energy Biosciences Institute.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kwas 2,5-dihydroksybenzoowy | Sigma-Aldrich | 37550 | 10mg/mL w wodzie |
| Żywica BioRex MSZ 501(D) | Bio-Rad | 142-7425 | |
| Endoglukanaza | Megazyme | E-CELTR | |
| Ksylanaza M6 | Megazyme | E-XYRU6 | |
| Metalowe kulki 3mm | Retsch | 22.455.0011 | |
| Młynek kulowy | Retsch | Mixer Mill MM400 | |
| MALDI-TOF | Shimadzu Corporation | Axima Performance | |
| Płyta docelowa MALDI | Kratos Analytical | DE4555TA | |
| SpeedVac | Eppendorf | Vacufuge 5301 | |
| Kolektor próżniowy | EMD Millipore | MSVMHTS00 | |
| Pompa próżniowa | Welch Allyn | DryFast Ultra 2032 |
Bibliografia
- Lerouxel, O. Rapid structural phenotyping of plant cell wall mutants by enzymatic oligosaccharide fingerprinting. Plant Physiology. 130 (4), 1754-1754 (2002).
- Obel, N. Microanalysis of plant cell wall polysaccharides. Molecular Plant. 2 (5), 922-922 (2009).
- Mouille, G. Quantitative trait loci analysis of primary cell wall composition in Arabidopsis. Plant Physiology. 141 (3), 1035-1035 (2006).
- Bauer, S. Development and application of a suite of polysaccharide-degrading enzymes for analyzing plant cell walls. PNAS. 103 (30), 11417-11417 (2006).
- Pauly, M. A xyloglucan-specific endo-beta-1,4-glucanase from Aspergillus aculeatus: expression cloning in yeast, purification and characterization of the recombinant enzyme. Glycobiology. 9 (1), 93-93 (1999).
- Aboughe-Angone, S. Cell wall carbohydrates from fruit pulp of Argania spinosa: structural analysis of pectin and xyloglucan polysaccharides. Carbohydr Res. 343 (1), 67-67 (2008).
- Brown, D. M. Comparison of five xylan synthesis mutants reveals new insight into the mechanisms of xylan synthesis. Plant Journal. 52 (6), 1154-1154 (2007).
- Lee, C. The PARVUS gene is expressed in cells undergoing secondary wall thickening and is essential for glucuronoxylan biosynthesis. Plant Cell Physiol. 48 (12), 1659-1659 (2007).
- Obel, N. Pectin may hinder the unfolding of xyloglucan chains during cell deformation: implications of the mechanical performance of Arabidopsis hypocotyls with pectin alterations. Molecular Plant . , (2009).
- Cavalier, D. M., Keegstra, K. Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).
- Leonard, R. Identification of an Arabidopsis gene encoding a GH95 alpha1,2-fucosidase active on xyloglucan oligo- and polysaccharides. Phytochemistry. 69 (10), 1983-1983 (2008).
- Cavalier, D. M., Keegstra, K. Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).
- Lee, C. H. The irregular xylem9 mutant is deficient in xylan xylosyltransferase activity. Plant and Cell Physiology. 48 (11), 1624-1624 (2007).
- Iglesias, N. Apoplastic glycosidases active against xyloglucan oligosaccharides of Arabidopsis thaliana. Plant and Cell Physiology. 47 (1), 55-55 (2006).
- Fujino, T., Sone, Y., Mitsuishi, Y., Itoh, T. Characterization of cross-links between cellulose microfibrils, and their occurrence during elongation growth in pea epicotyl. Plant Cell Physiol. 41 (4), 486-486 (2000).
- Vanzin, G. F. The mur2 mutant of Arabidopsis thaliana lacks fucosylated xyloglucan because of a lesion in fucosyltransferase AtFUT1. PNAS. 99 (5), 3340-3340 (2002).
- Cavalier, D. M. Disrupting two Arabidopsis thaliana xylosyltransferase genes results in plants deficient in xyloglucan, a major primary cell wall component. Plant Cell. 20 (6), 1519-1519 (2008).
- Hilz, H. A comparison of liquid chromatography, capillary electrophoresis, and mass spectrometry methods to determine xyloglucan structures in black currants. Journal of Chromatography A. 1133 (1-2), 275-275 (2006).
- Pauly, M. Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells. Planta. 214 (1), 67-67 (2001).
Przedruki i uprawnienia
