Niniejszy protokół opisuje sposób wykorzystania immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) do badania dynamicznych zmian w matrycy chromatyny, które regulują transkrypcję indukowaną przez szlak przekazywania sygnału.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) w celu badania dynamicznych modyfikacji histonów w aktywownej ekspresji genów w komórkach ludzkich
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W odpowiedzi na różnorodne ligandy zewnątrzkomórkowe, czynniki transkrypcyjne STAT (signal transducer and activator of transcription) są szybko rekrutowane ze swojego stanu utajonego w cytoplazmie do receptorów powierzchniowych komórki, gdzie ulegają aktywacji poprzez fosforylację pojedynczej reszty tyrozyny1. Następnie tworzą dimery i translokują do jądra komórkowego, aby stymulować transkrypcję genów docelowych, wpływając na wzrost, różnicowanie, homeostazę oraz odpowiedź immunologiczną. Biorąc pod uwagę ich szeroki udział w prawidłowych procesach komórkowych, nie jest zaskakujące, że dysregulacja funkcji STAT przyczynia się do rozwoju chorób ludzkich, w szczególności nowotworów2 oraz chorób autoimmunologicznych3.
Jest dobrze znane, że transkrypcja jest regulowana poprzez zmiany w matrycy chromatynowej4,5. Zmiany te obejmują aktywność kompleksów zależnych od ATP, a także kowalencyjne modyfikacje histonów i metylację DNA6. Ponieważ aktywacja ekspresji genów przez białka STAT jest zarówno szybka, jak i przejściowa, wymaga ona specyficznych mechanizmów modulowania matrycy chromatynowej w obrębie locus genów zależnych od STAT. Aby zdefiniować te mechanizmy, scharakteryzowaliśmy modyfikacje histonów oraz aktywności enzymatyczne, które je generują, w locus genów reagujących na sygnalizację STAT. Niniejszy protokół opisuje immunoprecypitację chromatyny, metodę cenną w badaniu wpływu sygnalizacji STAT na chromatynę podczas aktywowanej ekspresji genów.
Protokół
PLANOWANIE
Na dzień przed planowanym eksperymentem ChIP należy wyhodować komórki tak, aby zapewnić ich wystarczającą liczbę. Przyjmuje się, że każdy test ChIP wymaga ~1-1,5 x 107 komórek. Zawsze należy zaplanować wykonanie kontroli negatywnej (IgG) i pozytywnej (przeciwciało pan-histonowe) oraz powtórzeń eksperymentów.
Wskazówka - W przypadku komórek 2FTGH każdy test ChIP wymaga około jednejy szalki hodowlanej o średnicy 15 cm przy 80% konfluencji.
CZĘŚĆ 1: PRZYGOTOWANIE CHROMATYNY I WYKONA NIE ChIP
- Usunąć pożywkę i indukować komórki przez wymagany czas, dodając 20 mL 10% surowicy z cieląt (CCS)/DMEM zawierającej IFN-gamma w stężeniu 5 ng/mL. Na płytkach nieindukowanych zastąpić pożywkę również 20 mL 10% CCS/DMEM.
- W dygestorium dodać 540 μL 37% formaldehydu do 20 mL pożywki (stężenie końcowe 1%) w szalce 15 cm.
Wskazówka - Przechylić płytkę i dodać formaldehyd do skupiska pożywki, a następnie kołysać płytką, aby równomiernie go rozprowadzić. - Pozostawić do przebiegu sieciowania przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Dodać glicynę do stężenia końcowego 0,125 M, aby przerwać sieciowanie.
- Odssać pożywkę próżniowo i raz przemyć komórki 10 mL lodowatego roztworu soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS).
- Zebrać komórki skrobakiem komórkowym w ok. 7 mL PBS i połączyć komórki (z 6 płytek) traktowane w ten sam sposób w probówce stożkowej 50 mL na lodzie.
- Wirować (wirówka Beckman Coutler Allegra 12-R) przy 180 rpm w temperaturze 4°C przez 5 minut i odessać PBS.
Wskazówka - Jeśli proces jest przerywany na tym etapie, szybko zamrozić osad komórkowy i przechowywać w temperaturze -80°C. - Resuspender osad komórkowy w 4 mL buforu pęczniejącego (25 mM HEPES pH 7,8, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,1% NP40. Przed użyciem dodać 1 mM DTT, kompletnych inhibitorów proteaz i schłodzić na lodzie) i przenieść do probówki stożkowej 15 mL.
Wskazówka - Ta objętość buforu pęczniejącego jest odpowiednia dla zbiórki z 6 płytek (ok. 6-9 x 107 komórek). Większa lub mniejsza ilość buforu może zmienić wydajność homogenizacji w douncerze. - Inkubować zawiesinę komórkową na lodzie przez 10 minut.
- Przenieść zawiesinę do schłodzonego douncera 15 mL (Wheaton) i wykonać 20 pociągnięć tłuczkiem A.
- Przenieść homogenizowane komórki z powrotem do probówki stożkowej 15 mL na lodzie.
- Wirować przy 250 rpm przez 5 minut w temperaturze 4°C i odrzucić nadsącz.
- Resuspender osad jądrowy (ok. 20 μL z 6 płytek) w 3 mL (15 objętości osadu) buforu do sonikacji (50 mM HEPES pH 7,9, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-10, 0,1% deoksycholanu sodu, 0,1% SDS. Tuż przed użyciem dodać kompletne inhibitory proteaz i schłodzić na lodzie).
Wskazówka - Ta objętość buforu do sonikacji jest odpowiednia dla zbiórki z 6 płytek (ok. 6-9 x 107 komórek). Większa lub mniejsza ilość buforu może zmienić wydajność sonikacji. - Sonikować zawiesinę jąder na lodzie przez 10 cykli (20 sekund włączony/40 sekund wyłączony /ustawienie amplitudy na 8) przy użyciu sonikatora Misonix Sonicator 30 wyposażonego w mikrokońcówkę. Zazwyczaj skutkuje to powstaniem fragmentów chromatyny o średniej wielkości 20-10 bp.
Wskazówka - Ponieważ sonikatory różnią się od siebie, wydajność sonikacji należy określić empirycznie. W tym celu należy pobrać aliquoty po 20 μL przed sonikacją oraz po każdym cyklu sonikacji. Próbki te należy ogrzewać w 65°C przez 4 godziny. Następnie dodać bufor do ładowania DNA i przeprowadzić standardową elektroforezę na żelu agarozowym 1%/TBE, aby zwizualizować fragmenty DNA.)
- Przenieść sonikowany materiał do probówki wirówkowej SS34 i wirować przez 20 minut w temperaturze 4°C przy 130 rpm w rotorze SS34 (wirówka Sorvall RC6 Plus), abyt osadzić zazwyczaj niewielką ilość debris komórkowych.
- Ostrożnie przenieść nadsącz do probówki stożkowej 15 mL na lodzie.
- Przeprowadzić wstępne oczyszczanie (pre-clearing) poprzez dodanie 360 μL zawiesiny kulek agarozowych z DNA sperm plemników łososia/Białkiem A lub G i kołysanie w temperaturze 4°C przez co najmniej 30 minut.
Wskazówka - Ten krok zmniejsza poziom szumu w analizie, który wynika z niespecyficznych zdarzeń wiązania. - Wirować przy 10 rpm w temperaturze 4°C przez 5 minut, aby osadzić kulki agarozowe.
- Przenieść oczyszczony nadsącz do kolejnej probówki stożkowej 15 mL na lodzie.
- Zmierzyć jednostki A260 oczyszczonej chromatyny i dostosować objętość za pomocą buforu do sonikacji do czterech (4) jednostek A260 (0,2 mg/mL przy założeniu, że 1 jednostka A260 = 0,050 mg/ml).
Wskazówka - Aby zmierzyć jednostki A260, rozcieńczyć 10 μL oczyszczonej chromatyny w 190 μL DDW; spektrofotometr ustawić na zero (blank) za pomocą 10 μL buforu do sonikacji w 190 μL DDW.
- Odstawić 75 μL chromatyny (przy 4 jednostkach A260) jako próbkę wejściową (Input Sample) i przechowywać w temperaturze 20°C do momentu odwrócenia sieciowania.
Wskazówka - Ten krok jest kluczowy dla analizy danych. Nie można pominąć pobrania aliquoty wejściowej. - Rozdzielić przygotowaną chromatynę do probówek mikrocentryfugowych 1,7 mL na lodzie w aliquotach po 1 mL.
Wskazówka - Jeśli proces jest przerywany na tym etapie, szybko zamrozić przygotowaną chromatynę na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80°C. Uwaga: przechowywana chromatyna może ulec degradacji, co prowadzi do mniej niż optymalnych wyników, dlatego należy tego unikać w miarę możliwości. - Dodać przeciwciała klasy ChIP do zestawów próbek indukowanych i nieindukowanych w duplikacie. Dodać IgG (2 μg) i przeciwciało przeciwko pan Histonie H3 (15 μL) jako kontrole negatywną i pozytywną do zestawów próbek indukowanych i nieindukowanych.
Wskazówka - Ilość przeciwciała do użycia musi zostać określona empirycznie lub należy sprawdzić kartę produktu dostawcy w celu poznania sugerowanych ilości. Zazwyczaj 1-2 μg przeciwciała klasy ChIP działa dobrze. Odpowiednią objętość w przypadku przeciwciał dostarczanych w formie surowicy należy określić empirycznie.
- Kołysać wszystkie probówki przez noc w temperaturze 4°C.
CZĘŚĆ 2: WYDZIELANIE IMMUNOKOMPLEKSÓW
- Do wszystkich probówek dodać 60 μL zawiesiny kulek agarozowych Salmon Sperm DNA/Protein A lub Protein G.
Wskazówka Należy używać Protein A dla króliczych przeciwciał poliklonalnych oraz Protein G dla mysich przeciwciał monoklonalnych. - Inkubować w wytrząsarce w temperaturze 4°C przez co najmniej 60 minut.
- Ucieplić kompleksy immunologiczne (kulki agarozowe) poprzez delikatne wirowanie w mikrowirówce przy 200 rpm w temperaturze 4°C przez 3 minuty.
- Odssać nadsącz.
- Przemyć kompleksy immunologiczne 1 mL każdego z poniższych buforów do mycia przez 10 minut w wytrząsarce w temperaturze 4°C. Po każdym myciu wirować w mikrowirówce przez 3 minuty przy 200 rpm w temperaturze 4°C i odssać nadsącz. Próbki należy przechowywać w lodzie. PMSF należy dodać bezpośrednio przed użyciem.
- Bufor do mycia o niskim zasoleniu (Low Salt Wash) – 0.1% SDS, 1% Triton X-10, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF
- Bufor do mycia o wysokim zasoleniu (High Salt Wash) – 0.1% SDS, 1% Triton X-10, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM PMSF
- Bufor do mycia LiCl (LiCl Wash) – 0.25 M LiCl, 1% NP-40, 1% deoksycholan sodu, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 1 mM PMSF
- Bufor do mycia TE (TE Wash) – dwa mycia buforem TE – 10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF
- Usunąć ostatnią porcję buforu TE i dodać do kulek 50 μL buforu do elucji (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 10 mM EDTA, 1% SDS).
Wskazówka – Bufor do elucji należy przygotować na świeżo.
- Wymieszać kulki agarozowe w buforze do elucji za pomocą vorteksu i ogrzewać przez 30 minut w temperaturze 65°C.
Wskazówka – każdą probówkę należy vorteksować co najmniej co 10 minut w ciągu tych 30 minut. - Wirować w mikrowirówce przez 30 sekund przy 20 rpm i przenieść eluat do nowej probówki do mikrowirówki.
Wskazówka – podczas elucji należy rozmrozić próbki wejściowe i dodać do każdej z nich 50 μL buforu do elucji. Próbki te należy uwzględniać we wszystkich kolejnych etapach.
- Do wszystkich próbek dodać 5 M NaCl do stężenia końcowego 20 mM, a następnie wymieszać za pomocą vorteksu.
- Inkubować w temperaturze 65°C przez noc (lub co najmniej przez 4 godziny).
CZĘŚĆ 3: OCZYŚCZANIE DNA PO ChIP I DNA WEJŚCIOWEGO (INPUT)
- Wszystkie próbki wirować w mikrowirówce przez 30 sekund, aby zebrać kondensację z pokrywek.
- Do każdej probówki dodać 1 μL RNAse A (10 U/μL) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
- Dodać 10 μL 0,5 M EDTA, 40 μL 0,5 M Tris-Cl pH 6,5, 2 μL Proteinazy K (10 mg/mL) i inkubować w temperaturze 45°C przez 60 minut. Wskazówka: Przygotować master mix z tych odczynników i dodać 52 μL do każdej probówki.
- Próbki poddać ekstrakcji fenol/chloroform/alkohol izoamylowy, a następnie ekstrakcji chloroform/alkohol izoamylowy.
- Dodać 2 μL glikogenu (25 μg/μL) oraz 0,1 objętości 3 M octanu sodu pH 5,2 i wymieszać na wortexie.
- Dodać 2,5 objętości 10% etanolu i wymieszać na wortexie.
- Inkubować w temperaturze 20°C przez noc.
CZĘŚĆ 4: KONTYNUACJA OCZYSZCZANIA DNA ChIP oraz DNA INPUT
- Wiruj próbki w mikrocentry fudze przez minimum 20 minut przy 130 rpm w temperaturze 4°C, aby wytrącić pellety DNA/glikogenu.
- Przemyj pellety DNA/glikogenu 1 mL 70% etanolu.
- Osusz pellety na powietrzu lub szybko w wirówce próżniowej DNA Savant.
Wskazówka - Nie doprowadź do nadmiernego wysuszenia DNA. - Resuspender pellety DNA/glikogenu w 200 μL buforu TE.
- DNA (1 μL) jest gotowe do ilościowego oznaczenia za pomocą real-time PCR. Pozostałe DNA przechowywać w temperaturze 20°C.
Wskazówka - Użycie więcej niż 1 μL DNA może hamować reakcje real-time PCR, dlatego należy ostrożnie zwiększać skalę.
Część 5: REPREZENTATYWNE WYNIKI:
Próbki DNA z ChIP oraz Input są ilościowo oznaczane metodą Real-Time PCR 7,8 (Applied Biosystems 750 Fast Real-Time PCR System) przy użyciu starterów specyficznych dla analizowanego locus genu. Startery celujące w sekwencję genomiczną, o której wiadomo, że jest ona wzbogacona lub pozbawiona badanych modyfikacji histonowych, mogą służyć jako kontrole pozytywne i negatywne. Dane są prezentowane jako procent Inputu. Procedurę ChIP należy powtórzyć w całości z trzema powtórzeniami biologicznymi, aby upewnić się, że raportowane zmiany w modyfikacjach histonowych są istotne statystycznie.
Istnieje kilka istotnych kwestii, które należy rozważyć podczas wykorzystania real-time PCR do ilościowego oznaczania DNA, w tym projektowanie starterów, wydajność PCR oraz odpowiednia metoda obliczania procentowego udziału materiału wejściowego i procedury normalizacji. Podczas profilowania stopnia zajętości modyfikacji histonowych w obrębie genu, wydajność PCR musi być spójna dla wszystkich par starterów. Producent systemu real-time PCR może zapewnić niezbędne informacje oraz szkolenie.
Rycina 1 przedstawia reprezentatywne wyniki immunoprecypitacji chromatyny podczas aktywacji genu IRF1 przez STAT19, wywołanej przez IFN-γ.
Rycina 1. Obsadzenie STAT1, polimerazy RNA II i H3K36me3 jest dynamiczne podczas aktywacji genu IRF1 przez STAT1. (A, B, C) ChIP z użyciem przeciwciał α-H3K36me3, α-STAT1 i α-Pol II dla chromatyny pobranej z komórek 2FTGH indukowanych IFN-γ przez 30 minut (czerwone kwadraty), 1,5 godziny (niebieskie kółka), 5 godzin (zielone trójkąty) lub nieindukowanych (czarne romby). IgG stanowi kontrolę negatywną (szare krzyżyki). (D) Przeciwciało Pan H3 służy jako kontrola pozytywna i pokazuje stopień zajętości histonów w obrębie locus w warunkach indukowanych (niebieskie kółka) i nieindukowanych (czarne romby). Spadek w okolicy -5 bp wynika z ubytku nukleosomów, który występuje w miejscach inicjacji transkrypcji.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiony protokół ChIP został z sukcesem zastosowany w laboratorium do analizy ponad dwudziestu różnych modyfikacji histonów. Ponadto scharakteryzowaliśmy zmiany w zajętości czynników transkrypcyjnych, enzymów modyfikujących histony, białek rozpoznających modyfikacje histonów oraz aparatu transkrypcyjnego polimerazy RNA II w obrębie kilku genów indukowanych przez IFN-γ. Procedurę tę wykorzystaliśmy również do scharakteryzowania zmian w modyfikacjach histonów podczas różnicowania nowotworowej komórki macierzystej
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsza praca jest wspierana przez University of Virginia, University of Virginia Cancer Center oraz The Thomas F. and Kate Miller Jeffress Memorial Trust. Dziękujemy laboratorium Jamesa E. Darnell (Rockefeller University) oraz laboratorium Roberta Rossa (Fordham University) za udostępnienie linii komórkowych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 37% Formaldehyd | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Chloroform/alkohol izoamylowy | Acros Organics | AC32715-5000 | |
| Kompletny Mini zestaw inhibitorów proteaz | Roche Group | 1836153 | |
| Surowica cielęca Cosmic | Hyclone | SH30087.04N | |
| DMEM | Hyclone | SH30243 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Etanol | Pharmco Products, Inc. | zp1110EP | |
| Glicyna | Roche Group | 100149 | |
| Glikogen | Roche Group | 901393 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| IFN-gamma | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| IgG | Jackson ImmunoResearch | 109-005-003 | |
| KCl | MP Biomedicals | ||
| LiCl | Sigma-Aldrich | L4408 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Octan sodu | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Sód deoksycholanowy | Fisher Scientific | BP349-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| NP40 | US Biological | N3500 | |
| Przeciwciało przeciwko Histonie H3, CT, pan | EMD Millipore | 07-690 | |
| Fenol/chloroform/izoamyl | Fisher Scientific | 108-95-2 | |
| Fosforanowy bufor solny | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| PMSF | EMD Millipore | 50-230-0316 | |
| Proteinaza K | 5 PRIME | 2500140 | |
| RNAza A | 5 PRIME | 2500130 | |
| Agaroza z DNA sperm sperm łososia/Białkiem A | EMD Millipore | 16-157 | |
| Agaroza z DNA sperm sperm łososia/Białkiem G | EMD Millipore | 16-201 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris-Cl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327372500 | |
| Przeciwciało przeciwko K36me3 | Abcam | ab9050 | |
| Przeciwciało przeciwko STAT1 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-345X | |
| Przeciwciało przeciwko polimerazie RNA II | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-899 |
Bibliografia
- Levy, D., Darnell, J. E. Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).
- Bromberg, J., Darnell, J. E. Jr The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function. Oncogene. 19, 2468-2473 (2000).
- Hu, X., Ivashkiv, L. B. Cross-regulation of signaling pathways by interferon-gamma: implications for immune responses and autoimmune diseases. Immunity. 31, 539-550 (2009).
- Campos, E. I., Reinberg, D. Histones: annotating chromatin. Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).
- Kouzarides, T. Chromatin Modifications and Their Function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
- Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques. 22 (130-131), 134-138 (1997).
- Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., Griffith, R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology (N Y). 10, 413-417 (1992).
- Kroger, A., Koster, M., Schroeder, K., Hauser, H., Mueller, P. P. Activities of IRF-1. J Interferon Cytokine Res. 22, 5-14 (2002).
- Ross, R. A., Spengler, B. A. Human neuroblastoma stem cells. Seminars in cancer biology. 17, 241-247 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
