Dechorionizacja zarodków ryby medaka i transplantacja komórek w celu generowania chimer

Podsumowanie

Ze względu na twardy chorion i delikatne embriony, manipulacja zarodkami medaki jest bardziej skomplikowana niż w przypadku danio prążkowanego. W tym filmie zaprezentowano krok po kroku procedury manipulacji embrionami medaki, w tym usuwanie chorionu (dechorionację), unieruchamianie w agarozie do obrazowania oraz transplantację komórek w celu wytworzenia chimer. Procedury te są niezbędne do wykorzystania medaki i danio prążkowanego w laboratorium, aby w pełni skorzystać z ich komplementarnych cech w badaniach nad funkcjami genomu kręgowców.

Streszczenie

Medaka to mała, składająca jaja ryba słodkowodna, która umożliwia przeprowadzanie analiz genetycznych i embriologicznych i jest jednym z trzech kręgowców wykorzystywanych jako organizmy modelowe, w których przeprowadzono genomowe badania przesiewowe mutantów oparte na fenotypie ¹. Rozbieżność w funkcjonalnym nakładaniu się pokrewnych genów między medaką a danio przebrzosym pozwala na identyfikację nowych fenotypów, których nie można wykryć u jednego gatunku ², przez co medaka i danio przebrzosim są komplementarne w kontekście genetycznej analizy funkcji genomu kręgowców. Manipulacje z embrionami medaki, takie jak usuwanie otoczki jajowej (dechorionizacja), montowanie embrionów do obrazowania oraz transplantacja komórek, stanowią kluczowe procedury pracy z medaką i danio przebrzosim w warunkach laboratoryjnych. Transplantacja komórek służy do badania autonomii komórkowej mutacji u medaki. Chimery są generowane poprzez transplantację znakowanych komórek z embrionów dawców do nieznakowanych embrionów biorców. Komórki dawcy mogą być transplantowane do określonych obszarów embrionów biorców w oparciu o mapy losów ³, tak aby klony z transplantowanych komórek mogły zostać zintegrowane z interesującą nas tkanką podczas rozwoju. Ze względu na twardą otoczkę jajową i delikatne embriony, manipulacje z embrionami medaki są bardziej skomplikowane niż w przypadku danio przebrzosima. W niniejszym filmie przedstawiamy szczegółowe procedury manipulacji z embrionami medaki.

Protokół

1. Rozwój embrionów

1. Po złożeniu jaja tworzą skupiska ze względu na obecność nici przylepnych na chorionie. Aby umożliwić prawidłowy rozwój embrionów, konieczne jest rozdzielenie jaj. Nici przylepne należy rozplątać i odciąć, chwytając je za pomocą dwóch pincet.
2. Po rozdzieleniu skupisk jaja oddziela się od odchodów i alg, a następnie przenosi do świeżego medium dla embrionów, zachowując maksymalną gęstość 40 jaj na płytkę Petriego o średnicy 6cm.
3. Embriony medaki rozwijają się nieco wolniej niż danio pręgowany w temperaturze 27°C. Czas wyklucia różni się między tymi dwoma gatunkami; embriony medaki wykluwają się z chorionu w ciągu 7 dni i natychmiast zaczynają pływać oraz żerować, podczas gdy embriony danio pręgowanego wykluwają się w ciągu 2 dni, lecz zaczynają pływać i żerować w 5-6 dniu. Rozwój medaki jest określany zgodnie z systemem stadiów Iwamatsue⁴.
4. Rozwój embrionów medaki można wygodnie dostosować do planów doświadczalnych poprzez dobór odpowiedniej temperatury. Rozwój embrionów medaki można zatrzymać w temperaturze 4°C na wczesnym etapie rozwoju. Po stadium 24, kiedy rozpoczyna się bicie serca, rozwój można spowolnić, stosując temperaturę minimalną 18°C.
5. Czas pojawienia się organów/tkanek jest u medaki nieco inny niż u danio pręgowanego, t.j. u medaki somitogeneza następuje po rozpoczęciu rozwoju mózgu, podczas gdy u danio pręgowanego somitogeneza poprzedza rozwój mózgu.

2. Usuwanie chorionu

Chorion medaka składa się z dwóch warstw ochronnych: twardej warstwy wewnętrznej i miękkiej powierzchni zewnętrznej. W związku z tym, w celu usunięcia tego chorionu konieczne jest dwuetapowe opracowanie proteazą z użyciem pronazy i enzymu wyklutowego.

Po usunięciu chorionu embriony należy przechowywać w 1X BSS. Warunki półsterylne zwiększą powodzenie hodowli embrionów po dechorionacji, szczególnie w przypadku konieczności prowadzenia dłuższej obserwacji. Obejmuje to stosowanie sterylnych roztworów (np. sterylizowanego 1X BSS z antybiotykami) oraz narzędzi sterylizowanych 70% ethanolem, a następnie płukanych 1X BSS.

Ponieważ zdechorionowane zarodki medaki są bardziej miękkie i delikatne niż zdechorionowane zarodki danio pręgowanego, należy zachować szczególną ostrożność, aby nie miały one kontaktu z powietrzem lub pęcherzykami w pipecie, ponieważ spowoduje to ich natychmiastowe zapadnięcie się. Aby zminimalizować uszkodzenia zarodków, do ich przenoszenia należy używać szerkootworowej, wypalanej szklanej pipety z pompką, a do ich orientacji podczas obserwacji – pętelki z włosa. W celu zapobiegania przywieraniu zarodków do powierzchni należy stosować nieprzylepne szalki Petriego.

1. Przed dechorionacją należy sprawdzić, czy jaja zostały dostatecznie odseparowane i oczyszczone.
2. Ponieważ zarówno pronaza, jak i enzymy wykluwające są proteinazami, należy przechowywać je w lodzie i minimalizować czas ekspozycji embrionów na te enzymy.
3. Przenieść jaja na papier ścierny (ziarnistość p2000, wodoodporny) umieszczony w pokrywce szalki Petriego o średnicy 9 cm. Usunąć nadmiar medium, zapewniając jednocześnie pozostawienie objętości wystarczającej do zapobiegania wysychaniu embrionów.
4. Delikatnie toczyć embriony przez około 45-60 sekund, aby usunąć część włosków z powierzchni zewnętrznej i lekko naciąć powierzchnię chorionu (Rysunek 1). Przenieść embriony z powrotem do oryginalnej szalki Petriego i zbadać.
   
   Podczas toczenia embrionów na papierze ściernym należy używać palca wskazującego, wywierając minimalny nacisk i trzymając palec równolegle do powierzchni papieru ściernego. Nie toczyć więcej niż 5-7 embrionów jednocześnie. Środek ostrożności ten zminimalizuje ryzyko zmiażdżenia embrionów pod wpływem siebie nawzajem.
   
   
5. Zastąpić medium do jaj w szalce roztworem pronazy o stężeniu 20 mg/ml i inkubować embriony przez 40-60 minut w temperaturze 27°C.
   
   Należy upewnić się, że embriony są dostatecznie przykryte pronazą, a szalka jest zamknięta pokrywką. Niewykorzystana pronaza powinna być przechowywana w lodzie podczas tego etapu, aby zminimalizować autolizę; można ją ponownie wykorzystać do czasu utraty aktywności (około 1-2 tygodni).
   
   
6. Odzyskać pronazę do ponownego użycia i przemyć embriony 5 razy w medium do embrionów, aby usunąć ślady pronazy, ponieważ zneutralizowałaby ona dodawany później enzym wykluwający.
7. Usunąć medium do embrionów i przykryć embriony enzymem wykluwającym, dbając o to, aby embriony tworzyły w szalce monowarstwę.
   
   Jeśli jaja będą leżeć jedno na drugim w szalce, te na spodzie zostaną zmiażdżone w miarę rozpuszczania się chorionu. Niewykorzystany enzym wykluwający przechowywać w lodzie.
   
   
8. Inkubować embriony w temperaturze 27°C, a po 15 minutach okresowo sprawdzać postęp wykluwania za pomocą stereomikroskopu.
   
   Zauważalne będzie pojawienie się licznych otworów przypominających kratery księżycowe w wewnętrznej warstwie chorionu, która wkrótce po tym ulega rozpuszczeniu, pozostawiając miękką warstwę zewnętrzną chorionu, którą można łatwo usunąć ręcznie. Cały proces wykluwania może trwać od 15 do 60 minut.
   
   
9. Gdy tylko embriony wyjdą z chorionu, przenieść je do szalki Petriego zawierającej 1X BSS.
   
   Należy uważać, aby nie przenieść enzymu wykluwającego do 1X BSS; należy dotknąć końcówką pipety powierzchni BSS, pozwalając embrionom delikatnie się wysunąć.
   
   
10. Po przeniesieniu wszystkich embrionów z enzymu wykluwającego, wykonać końcowe przeniesienie do kolejnej świeżej szalki z 1X BSS.
    
    Zapewnia to, że embriony nie będą narażone na żadne pozostałości enzymu wykluwającego, który mógłby uszkodzić odsłonięte embriony. W tej końcowej szalce wszystkie embriony, które nadal posiadają zewnętrzną warstwę chorionu, można uwolnić ręcznie za pomocą wysterylizowanej mikropincety pod stereomikroskopem.
    
    Jeśli po dechorionacji wymagana jest dalsza inkubacja embrionów, do BSS należy dodać penicylinę/streptomycynę, aby zapobiec wzrostowi bakterii.
    
    

Rysunek 1. Porównanie zarodków zwiniętych i rozwiniętych podczas dechorionacji. Zwróć uwagę, że zwinięte zarodki na panelu B nie posiadają włosków widocznych na rozwiniętych zarodkach na panelu A.

3. Montaż zdechorionowanych zarodków

Zatapianie w agarozy jest przydatne podczas dłuższego obrazowania (np. obrazowania poklatkowego) żywych embrionów, a także do szczegółowych obserwacji embrionów utrwalonych. Podczas gastrulacji i wczesnej organogenezy (od stadium 14 do stadium 28), embriony medaki wykazują fale rytmicznych ruchów kurczliwych w obrębie perydermy, warstwy tkanki pokrywającej zarówno rozwijający się embrion, jak i żółtko ⁵. Embriony są traktowane 3.5mM 1-heptanolem w celu zatrzymania ruchów kurczliwych ⁶.

Aby zatrzymać ruch zarodków po stadium 28 (64hpf), przed zatopieniem poddaje się je znieczuleniu poprzez dodanie kropel mezylanu trikainy (TMS). TMS dodaje się również do agarozy (należy dodać minimalną ilość, dawkę tę należy zoptymalizować, rozcieńczenie wynosi około 1:25).

1. Odmrozić niewielką ilość 3% agarozy o niskiej temperaturze żelowania (w 1X BSS) poprzez podgrzanie do 37°C i utrzymać w tej temperaturze.
2. Następne kroki należy wykonać szybko, aby zapobiec zastygnięciu agarozy przed zorientowaniem zarodka. Za pomocą szerokopysistej pipety szklanej przenieść taką ilość roztopionej agarozy, aby wypełnić zagłębienie zakrętki probówki typu Eppendorf.
3. Przenieść jeden zdechorionowany zarodek do zagłębienia zakrętki, minimalizując ilość przenoszonego BSS wraz z zarodkiem. Natychmiast pobrać agarozę wraz z zarodkiem z zagłębienia zakrętki i przenieść do komory hodowlanej w szalce Petriego.
   
   Należy użyć szalki Petriego o średnicy 3,5 cm z szklanym okienkiem na dnie. W przypadku obrazowania za pomocą mikroskopu odwróconego, zarodki orientuje się brzuchem do dołu i umieszcza blisko szkiełka nakrywkowe. W przypadku obrazowania za pomocą mikroskopu prostego, minimalizuje się grubość warstwy agarozy.
   
   
4. Przenieść szalkę Petriego 3,5 cm do szalki Petriego o średnicy 14 cm zawierającej lód i wodę (wodę nalać do około 1/3 całkowitej głębokości dużej szalki). Mocno dociskając komorę do dna szalki Petriego 14 cm, użyć pętelki z włosa, aby delikatnie zorientować zarodek w roztopionej agarozie zgodnie z potrzebami i utrzymać go w tej pozycji do czasu zastygnięcia agarozy, delikatnie podnosząc i opuszczając mniejszą szalkę do jej pierwotnej pozycji w lodowatej wodzie.

4. Transplantacja komórek do embrionów ryby medaka

Celem niniejszej procedury jest ustalenie, czy analizowany gen działa w sposób autonomiczny komórkowo (wewnątrz komórki), czy nieautonomiczny komórkowo (między komórkami).

Komórki dawcy mogą zostać oznakowane barwnikiem śledzącym, takim jak rodamina-dekstran, przed transplantacją (zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole JoVE „Microinjection Of Medaka Embryos”) lub można wykorzystać szczep transgeniczny z ekspresją GFP, co umożliwia ocenę transplantacji. Kombinacja obu technik oznakowania jest często przydatna w celu wyeliminowania autofluorescencji, która może wystąpić. W badaniach time-lapse prowadzonych po transplantacji szczególnie przydatna jest ekspresja GFP.

Przez cały czas trwania tej procedury należy używać szklanej pipety o szerokim wylocie z pompką do pipet, a wszystkie narzędzia (w tym szkiełka) należy uprzednio wysterylizować 70% EtOH, a następnie dokładnie wypłukać sterylnym 1X BSS. Zarczepy biorące (recipient embryos) są zazwyczaj rozwinięte do około stadium 12, co umożliwia rozróżnienie bieguna brzusznego i grzbietowego podczas przeprowadzania transplantacji.

1. Rozpocząć usuwanie chorionu z embrionów na 1,5 godziny przed transplantacją i przygotować aparat do iniekcji podczas inkubacji z enzymami.
2. Umieścić szkiełko mikroskopowe z wgłębieniem w czarce Petri o średnicy 9 cm.
3. Za pomocą sterylnej końcówki pipety nanieść niewielką ilość 3% metylocelulozy na środek wgłębienia szkiełka i rozprowadzić cienką warstwą.
4. Suszyć metylocelulozę przez około 1-2 minuty.
5. Dodać 350μl sterylnego 1X BSS, aby wypełnić wgłębienie szkiełka.
6. Przenieść jeden embrion donora i do czterech embrionów biorców na szkiełko za pomocą szklanej pipety.
7. Zorientować embriony za pomocą pętli z włosa tak, aby blastoderm embrionu był skierowany do góry.
   
   Embriony można oprzeć o siebie, aby dodatkowo zwiększyć ich stabilność.
   
   
8. Ostrożnie wprowadzić mikroigłę do blastodermy donora i powoli pobrać 10-20 komórek.
9. Ostrożnie wprowadzić igłę w wymagany obszar blastodermy embrionu biorcy i powoli wypuścić komórki. Należy zachować szczególną ostrożność podczas wprowadzania komórek do blastodermy biorcy, aby nie naruszyć granicy między komórkami a workiem żółtkowym, ponieważ spowoduje to śmierć embrionu.
10. Wlać wysterylizowany 1X BSS do czarki Petri.
    
    BSS należy wlewać ostrożnie, jak najbliżej ścianki czarki, aby nie poruszyć embrionów. Nigdy nie wlewać BSS bezpośrednio na embriony i dodać wystarczającą ilość BSS, aby szkiełko i embriony były całkowicie zanurzone.
    
    
11. Dodać do czarki 100μl penicyliny/streptomycyny i przykryć. Ostrożnie przenieść czarkę do inkubatora w temperaturze 27°C, aby umożliwić prawidłowy rozwój.
12. Embriony można okresowo obserwować w zależności od potrzeb. Podczas stosowania transplantacji w celu przeprowadzenia eksperymentów typu gain-of-function i/lub ratowania fenotypu, niektóre zaobserwowane zmiany morfologiczne mogą wynikać z efektów samej transplantacji. Dlatego konieczne jest przeprowadzenie wielokrotnych transplantacji. Po 2-3 dniach na worku żółtkowym, głowie, oczach i tułowiu powinny pojawić się melanofory. Jeśli są obecne na transplantowanych embrionach, najprawdopodobniej udało się stworzyć udaną chimerę (Rycina 3).

W razie potrzeby przeprowadź genotypowanie zarodka/zarodków dawcy, przenosząc je do probówek do PCR zawierających 25μl proteinazy K w stężeniu 20mg/ml. Inkubuj w temperaturze 55°C przez 4 godziny, a następnie przez 10 minut w 94°C i przeprowadź reakcję PCR.

5. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 2. Przykładowe ułożenie zarodka zatopionego w agarozie. Strona przednia znajduje się po prawej stronie, widok od strony grzbietowej. Panel B: komórki śródbłonka są widoczne po obu stronach ciała zarodka i są oznakowane za pomocą GFP sterowanego przez promotor fli.

Rysunek 3. Obrazy embrionów po transplantacji. Obraz A przedstawia embrion dawcy i biorcy bezpośrednio po transplantacji. Embrion dawcy znajduje się po prawej stronie i wykazuje całkowicie czerwony blastoderm (strzałka). Embrion biorcy znajduje się po lewej stronie i jest łatwo identyfikowalny dzięki małej masie czerwonych przeszczepionych komórek widocznych w blastodermie (grot strzałki). Obraz B przedstawia dwa embriony biorców około 7 godzin po transplantacji (inkubowane w 27°C). Zauważ, że przeszczepione komórki zmigrowały z miejsca transplantacji i są teraz rozproszone w blastodermie (strzałki). Obraz C przedstawia embrion biorcy w stadium st.29 (około 74hpf). Zwróć uwagę na pigmentację oka oraz obecność melanoforów w regionie tułowia i mózgu (strzałki). Widać, że komórki znakowane rhodaminą kolonizują wiele struktur embrionalnych, co wskazuje na pomyślne wytworzenie chimery.

Dyskusja

W tym filmie demonstrujemy, jak przeprowadzić dechorionację oraz transplantację komórek u embrionów medaka. Jest to potężna technika pozwalająca na wytworzenie embrionów chimerycznych w celu badania funkcji genów/białek podczas rozwoju, a także w celu wyjaśnienia autonomii badanego genu/białka. Medaka stanowią użyteczny kręgosłupowy model badawczy dla tej techniki ze względu na dobrze opracowane mapy losów komórek oraz ich przezroczystość, która sprzyja obrazowaniu in vivo w czasie rzeczywistym. Transplantację można połączyć z mikroiniekcją (zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole JoVE „Microinjection Of Medaka Embryos”), co pozwala na łatwą obserwację zachowania przeszczepionych komórek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywka dla zarodków	Odczynnik	Przygotowano wewnętrznie	N/A	200ml 50X roztworu zapasu, 1ml 1% błękitu metylenowego w H2O/10 litrów wody RO (roztwór zapasu 50X: NaCl 14,7g, KCl 0,6g, CaCl2 2H2O 2,4g, MgSO4 7H2O 4,0g/1 litr wody RO.)
Pinceta mikrochirurgiczna	Narzędzia	55 INOX A.DUMONT&FILS	N/A	Bardzo ostre, cienkie końcówki do usuwania chorionu.
Drobnoziarnisty wodoodporny papier ścierny – ziarnistość p2000	Narzędzia	Hermes Abrasives Ltd.	N/A	Bardzo drobna ziarnistość do toczenia/oczyszczania zarodków z chorionami.
3% metyloceluloza	Odczynnik	Sigma	M 0512	Wysoka lepkość w celu unieruchomienia zarodków podczas transplantacji.
1X BSS	Odczynnik	Przygotowano wewnętrznie	N/A	20XBSS: 130g NaCl, 8g KCl, 4g MgSO4.7H2O, 4g CaCl2.2H2O oraz 10mg czerwieni fenolowej w 1L wody MilliQ, autoklawowanie; 500mM Hepes w wodzie MilliQ, autoklawowanie. Dodać 25ml 20XBSS i 15ml 500mM Hepes pH 7,0, uzupełnić do 500ml i wysterylizować przez filtrację przed użyciem.
Penicylina-streptomycyna	Odczynnik	Gibco	15140-122	Dodawana do BSS podczas inkubacji zdechorionowanych zarodków.
Pronaza	Odczynnik	Calbiochem	53702	Do zdechorionowania.
Enzym wykluwający	Odczynnik	Przygotowano wewnętrznie	N/A	Do zdechorionowania.
Trikainy mezylan (TMS)	Odczynnik	Sigma	A-5040	400mg trikainy w 97,9ml wody destylowanej i 2,1ml 1M Tris, pH dostosowane do 7; 4,2ml tego roztworu w 100ml czystej wody z akwarium.
3% agaroza o bardzo niskiej temperaturze żelowania	Odczynnik	Sigma	A-2576	Typ IX-A. Stosowana podczas zatapiania zarodków do obserwacji.
Komora hodowlana wypracowana z płytki Petriego	Narzędzie	Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.	11-004-008	Szklana płytka Iwaki 35mm z okienkiem 12mm. Stosowana podczas zatapiania zarodków do obserwacji.
Mikromanipulator	Sprzęt	Narishige	N/A	Model MN151. Do usuwania i wprowadzania komórek podczas transplantacji.
Kapilary z borokrzemianowego szkła	Narzędzie	Harvard Apparatus	GC100-10T	Do tworzenia igieł transplantacyjnych.
Wypalarka/wyciągacz mikropipet Brown	Sprzęt	Sutter Instrument Co.	Model P-97	Do tworzenia igieł transplantacyjnych.