Ten protokół dostarcza niezbędnych informacji do zakładania, pielęgnacji, rejestrowania i elektrycznego stymulowania kultur na MEA. Sieci in vitro dostarczają środków do zadawania fizjologicznie istotnych pytań na poziomie sieci i komórki, co prowadzi do lepszego zrozumienia funkcji i dysfunkcji mózgu.
Artykuł metodologiczny
Jak hodować, rejestrować i stymulować sieci neuronowe na matrycach mikroelektrod (MEA)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przez ostatnie stulecie, wielu neurobiologów na całym świecie poświęciło swoje życie na zrozumienie, jak działają sieci neuronowe i dlaczego przestają działać w różnych chorobach. Badania obejmowały obserwację neuropatologiczną, mikroskopię fluorescencyjną ze znakowaniem genetycznym oraz zapis wewnątrzkomórkowy zarówno w zdysocjowanych neuronach, jak i preparatach warstwowych. W protokole omówiono inną technologię, która polega na hodowaniu zdysocjowanych kultur neuronalnych na matrycach mikroelektrod (zwanych również matrycami wieloelektrodowymi, MEA).
Istnieje wiele zalet korzystania z tego systemu w porównaniu z innymi technologiami. Zdysocjowane kultury neuronalne na MEA zapewniają uproszczony model, w którym aktywnością sieci można manipulować za pomocą sekwencji stymulacji elektrycznej za pomocą wielu elektrod matrycy. Ponieważ sieć jest niewielka, wpływ stymulacji jest ograniczony do obserwowalnych obszarów, co nie ma miejsca w przypadku nienaruszonych preparatów. Komórki rosną w monowarstwie, dzięki czemu zmiany w morfologii są łatwe do monitorowania za pomocą różnych technik obrazowania. Wreszcie, kultury na MEA mogą przetrwać ponad rok in vitro, co usuwa wszelkie wyraźne ograniczenia czasowe związane z innymi technikami hodowli. 1
Nasze laboratorium i inne na całym świecie wykorzystują tę technologię do zadawania ważnych pytań na temat sieci neuronowych. Celem tego protokołu jest dostarczenie informacji niezbędnych do zakładania, pielęgnacji, rejestrowania i stymulacji elektrycznej kultur na MEA. Sieci in vitro zapewniają środki do zadawania fizjologicznie istotnych pytań na poziomie sieci i komórek, co prowadzi do lepszego zrozumienia funkcji i dysfunkcji mózgu.
Protokół
A. Wstęp
W ludzkim mózgu znajdują się miliardy neuronów. Każdy z tych neuronów może posiadać od setek do tysięcy połączeń, często z wieloma różnymi komórkami. Połączenia te przenoszą sygnały, które pozwalają nam chodzić, grać na pianinie, jeździć na rowerze, śmiać się, płakać i zapamiętywać. Przez ostatnie stulecie wielu neuronaukowców na całym świecie poświęcało życie zrozumieniu, jak działają sieci neuronalne i dlaczego przestają one funkcjonować w przebiegu różnych chorób.
Istnieje wiele narzędzi, z których można korzystać, podejmując to pozornie nie do pokonania zadanie. Wczesne badania koncentrowały się na obserwacjach neuropatologicznych dotyczących organizacji obwodów neuronalnych w mózgach ludzi i innych zwierząt. Pojawienie się mikroskopii fluorescencyjnej oraz znakowania genetycznego rozszerzyło zakres tych badań strukturalnych, umożliwiając analizę składu komórkowego aż do poziomu białek i DNA.
Jednak eksperymenty te nie odnosiły się do dynamicznej funkcji mózgu, a jedynie do jego statycznej budowy. Aby zrozumieć trwającą aktywność neuronalną, popularne techniki zazwyczaj koncentrują się na badaniu aktywności elektrofizjologicznej za pomocą rejestracji wewnątrzkomórkowej. Pojedyncze neurony z kultur dysocjowanych stanowią użyteczny model redukcjonistyczny, jednak technika ta jest ograniczona przez krótkie przedziały czasowe rejestracji z pojedynczych komórek. Model ten dostarcza również ograniczonych informacji o innych komórkach w sieci. Przekroje mózgu gryzoni zapewniają bardziej realistyczny model, w którym zachowana jest architektura kory. Jednak takie przekroje, nawet po wyhodowaniu w kulturze, mają ograniczoną żywotność, a ich utrzymanie przy jednoczesnym zachowaniu cytoarchitektury może być trudne pod względem technicznym2.
Inna technologia polega na hodowli dysocjowanych kultur neuronalnych na macierzach mikroelektrod (zwanych również macierzami wieloelektrodowymi, MEAs). Neurony wysiewa się na MEAs, które mają mikroelektrody wbudowane w dno naczynia. W ciągu trzech tygodni kultury te tworzą sieci neuronów z aksonami, dendrytami i setkami, a nawet tysiącami połączeń synaptycznych. Stosowanie tego systemu niesie ze sobą wiele zalet w porównaniu z innymi technologiami. Dysocjowane kultury neuronalne na MEAs stanowią uproszczony model badawczy (rzędu pojedynczej kolumny korowej, a nie całego, nienaruszonego mózgu). Komórki rosną w warstwie jednowarstwowej, co ułatwia monitorowanie zmian morfologicznych za pomocą różnych technik obrazowania. Aktywność sieci można manipulować za pomocą sekwencji stymulacji elektrycznej poprzez wiele elektrod macierzy. Ze względu na niewielki rozmiar sieci, wpływ stymulacji ogranicza się do obszarów obserwowalnych, co nie ma miejsca w preparatach nienaruszonych. Wreszcie, kultury na MEAs mogą przetrwać in vitro ponad rok, co eliminuje wyraźne ograniczenia czasowe właściwe dla innych technik hodowli.1 Zatem kultury na MEAs stanowią idealny model do badania łączności neuronalnej.
Nasze laboratorium oraz inne ośrodki na całym świecie wykorzystują tę technologię do badania kluczowych kwestii dotyczących sieci neuronalnych. Obecnie za pomocą tego modelu badane procesy neuronalne obejmują dynamikę sieci, rozwój, uczenie się i pamięć, plastyczność synaptyczną, ekscytotoksyczność, niedokrwienie oraz neurodegenerację.3-10 Wyniki tych badań mogą mieć istotne znaczenie dla opracowania lepszych metod leczenia ludzkich schorzeń, takich jak wady wrodzone, epilepsja, udar oraz choroba Alzheimera. Celem niniejszego protokołu jest dostarczenie niezbędnych informacji na temat tworzenia, pielęgnacji, rejestracji sygnałów oraz stymulacji kultur na MEA. Nadrzędnym celem jest umożliwienie badaczom stawiania fizjologicznie istotnych pytań na poziomie komórkowym i sieciowym, co może prowadzić do lepszego zrozumienia funkcji i dysfunkcji mózgu, a w konsekwencji do opracowania leczenia chorób wpływających na neurony i sposób ich komunikacji.
Poniższy protokół reprezentuje ponad 10-letnie doświadczenie naszego laboratorium w hodowli, rejestracji i stymulacji sieci neuronalnych na matrycach mikroelektrodowych. Każdy krok został zoptymalizowany w celu uzyskania długo żyjących, zdrowych sieci neuronalnych. W odpowiednich miejscach podano referencje, natomiast niektóre optymalne ustawienia zostały określone empirycznie. Przed rozpoczęciem protokołu należy pozyskać sprzęt i materiały oraz przygotować roztwory wymienione w sekcji „Materiały”. Sekcja dotycząca „Disekcji mózgu” zostanie krótko omówiona, ale nie będzie zaprezentowana w towarzyszącym filmie, ponieważ temat ten jest opisany w innych artykułach Journal of Visualized Experiment11.
B. Disekcja mózgu
- Całe mózgi są pobierane od szczurów w 18. dniu embrionalnym (E18). Ciężarne samice szczurów są znieczulane izofluranem drogą wziewną, a następnie poddawane dekapitacji. Zarodki są usuwane i sekcjowane zgodnie z wytycznymi National Research Council's Guide for the care and use of laboratory animals, przy zastosowaniu protokołu zatwierdzonego przez IACUC Uniwersytetu Emory.
- Z zachowaniem technik aseptycznych mózgi embrionalne są usuwane i umieszczane w zimnym roztworze soli zrównoważonych Hanksa (HBSS) w sterylnej szalce Petriego o średnicy 100 mm. Pozostała część protokołu sekcji odbywa się pod mikroskopem sekcyjnym w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby zminimalizować ryzyko kontaminacji.
- Mózgi szczurów są przenoszone pojedynczo do drugiej sterylnej szalki Petriego z HBSS w celu sekcji. Podczas zanurzenia w HBSS odcinane są pień mózgu, wzgórze i móżdżek, a półkule są przecinane na pół.
- Guzowatość węchowa służy jako uchwyt do stabilizacji półkuli podczas delikatnego usuwania opon mózgowych.
- Kora jest następnie oddzielana od leżącego pod nią hipokampa i prążkowia, a następnie przechowywana w sterylnej probówce stożkowej o pojemności 15 ml w roztworze hibernate na lodzie.12 Ponieważ zazwyczaj dostępnych jest wiele zarodków, procedurę tę powtarza się w zależności od pożądanej liczby MEA do wysiania oraz wymaganej gęstości komórek. Kory są łączone w procesie dysocjacji komórek, który opisano poniżej. Kory mogą być przechowywane w temperaturze 4°C w roztworze hibernate do 24 godzin przed dysocjacją przy minimalnej utracie żywotności komórek. Jako alternatywę dla tkanek sekcjowanych we własnym zakresie, można zakupić sekcjonowaną tkankę mózgową w firmie Brain Bits (www.brainbitsllc.com).
C. Przygotowanie MEA i dysocjacja kory
- Matryce MEA pozyskuje się z ALA Scientific (www.alascience.com), dostawcy producenta Multi-Channel Systems. Istnieje kilka różnych konfiguracji MEA z wariantami orientacji i odstępów między elektrodami, obecnością lub brakiem wewnętrznej elektrody uziemiającej, obecnością lub brakiem pierścienia szklanego oraz różną wielkością pierścienia szklanego. W naszych podstawowych eksperymentach stosujemy standardową matrycę mikroelektrod zawierającą 60 elektrod w układzie siatki 8 na 8 z małym pierścieniem szklanym. Średnica elektrody z azotku tytanu wynosi 30 μm, a odległość między środkami elektrod to 200 μm. Jedna z elektrod jest większa i pełni funkcję elektrody uziemiającej lub wewnętrznej elektrody odniesienia. Podczas pracy z MEA niezwykle ważne jest, aby żadne twarde przedmioty (np. końcówki pipet, chusteczki papierowe lub gumowe policemeny) nie dotykały wnętrza naczynia, ponieważ może to uszkodzić elektrody. Bardziej szczegółowe informacje na temat MEA i zasad postępowania z nimi znajdują się w instrukcji obsługi MEA (www.multichannelsystems.com/products-mea/microelectrode-arrays.html).
- Wieczorem w dniu poprzedzającym przygotowanie komórek matryce MEA płucze się wodą dejonizowaną, a następnie namacza w 70% etanolu przez 15 minut. Następnie naczynia umieszcza się w komorze z laminarnym przepływem powietrza z włączonym światłem UV na całą noc. W celu ułatwienia obsługi każda matryca MEA jest umieszczana w standardowej sterylnej szalce Petriego z polistyrenu o średnicy 100 mm, na której nanosi się datę i etykietę. Należy zaznaczyć, że w instrukcji obsługi MEA wspomniano o innych technikach sterylizacji, w tym o autoklawowaniu i stosowaniu wody o temperaturze 90°C. Empirycznie stwierdziliśmy jednak, że autoklawowanie wydaje się zmniejszać liczbę możliwych cykli użycia MEA. W przypadku ponownego wykorzystania MEA, na których znajdują się obecnie kultury, należy usunąć materię organiczną. 300-400 μl 0,25% trypsyny w PBS inkubuje się na MEA w temperaturze 35-37°C przez 20 minut. MEA płucze się wodą dejonizowaną, a następnie ogląda pod mikroskopem świetlnym. Jeśli materia komórkowa nadal jest obecna, etap z trypsyną powtarza się do momentu uzyskania czystości. Jeśli naczynie jest czyste, przechodzi się do etapu sterylizacji opisanego powyżej. Ogólnie rzecz biorąc, przy odpowiedniej staranności MEA można wykorzystać wielokrotnie.
- Również wieczorem przed wysiewaniem przygotowuje się i autoklawuje pokrywki do MEA. Pokrywki są wykonywane na zamówienie, ale można je również nabyć od ALA-Scientific. Wykonane są z politetrafluoroetylenu (Teflon) i mają rozciągniętą na górze przezroczystą membranę (fluorowany etylen-propylen, Teflon). Membrana umożliwia dyfuzję gazów, ale ogranicza dyfuzję wody, co w praktyce eliminuje potrzebę zapewnienia nawilżonej atmosfery i zapobiega szkodliwym efektom parowania oraz hiperosmolarności.1
- Po zakończeniu powyższej sekcji, przygotowanie MEA kontynuuje się poprzez naniosienie 100 μl roztworu polietyleniminy (PEI) do centrum każdej matrycy MEA.13 W naszych doświadczeniach roztwór PEI zapewnia mniejszą tendencję komórek do tworzenia skupisk w MEA niż w przypadku stosowania polilizyny. Naczynie pozostawia się w temperaturze pokojowej w komorze z laminarnym przepływem powietrza na 30 minut, z lekko przyłożonymi pokrywkami na MEA, aby zapobiec parowaniu. Przypominamy, że wszelkie prace z otwartą matrycą MEA lub tkanką mózgową powinny odbywać się w standardowej komorze z laminarnym przepływem powietrza do hodowli komórkowych, aby zminimalizować ryzyko kontaminacji.
- Następnie MEA płucze się 3 razy 1-2 ml sterylnej wody dejonizowanej. Idealna konfiguracja komory z laminarnym przepływem powietrza powinna zawierać aparat aspiracyjny do usuwania cieczy z naczyń. Do rurki aspiratora można przymocować sterylną końcówkę pipety 200 μl. Podczas aspiracji nie należy dotykać powierzchni MEA, ponieważ może to uszkodzić elektrody. Po ostatnim płukaniu MEA pozostawia się do wyschnięcia na co najmniej 30 minut w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
- W czasie wysychania rozpoczyna się proces dysocjacji neuronów, umieszczając korę w 2 ml roztworu papainy w sterylnej stożkowej probówce plastikowej o pojemności 15 ml.1 Do mieszaniny dodaje się 50 μl DNazy. Probówkę umieszcza się w łaźni wodnej w temperaturze 35-37°C i inkubuje przez około 20 minut. Co 5 minut należy delikatnie opukać probówkę w celu wymieszania, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. W miarę postępu trawienia kora powinna nabrać „puszystego” wyglądu.
- Roztwór papainy ostrożnie usuwa się za pomocą pipety, pozostawiając korę w stożkowej probówce 15 ml. Do kory dodaje się 2 ml pożywki komórkowej, inkubuje przez 2-3 minuty, a następnie delikatnie usuwa. Ma to na celu wypłukanie pozostałości papainy, która zostanie również zneutralizowana przez surowicę zawartą w pożywce. Do kory dodaje się kolejne 2 ml pożywki komórkowej, a próbkę tę poddaje się wortexowaniu z wysoką prędkością przez 5-10 sekund. Na dnie stożkowej probówki 15 ml powinien znajdować się mętny roztwór i nie powinno być pozostałych fragmentów mózgu. Alternatywnie, do dysocjacji tkanki można zastosować tryturację 1 ml pożywki za pomocą trzykrotnego pipetowania pipetą ręczną P-1000.1 Dla prawidłowej tryturacji każde pociągnięcie pipety powinno trwać jedną sekundę.
- Następnie roztwór powoli przepuszcza się grawitacyjnie przez sterylne sito komórkowe 40 μm. Roztwór komórek dodaje się powoli, kropla po kropli, do sita za pomocą pipety P-1000. Do zbierania przesianego roztworu komórek wykorzystuje się sterylną szalkę Petriego 35 mm.
- Zawiesinę komórkową przenosi się następnie z powrotem do stożkowej probówki 15 ml i dodaje pożywkę komórkową do uzyskania objętości końcowej 4,0 ml.14
- Następnie za pomocą pipety P-1000 ostrożnie nanosi się na dno stożkowej probówki 15 ml warstwę 500 μl 5% (w/v) roztworu BSA.14 Spowoduje to wypchnięcie roztworu zawierającego komórki ku górze probówki.
- Roztwór komórek z warstwą BSA na dnie wiruje się następnie przez 6 minut przy 200 x g w celu usunięcia drobnych zanieczyszczeń i potencjalnie toksycznej zawartości wewnątrzkomórkowej.14
- Podczas wirowania komórek dokonuje się wizualnej oceny MEA, aby upewnić się, że są one całkowicie suche. Następnie do centrum MEA ostrożnie nanosi się 20 μl roztworu lamininy, upewniając się, że wszystkie elektrody są pokryte.1 Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza do tego roztworu, ponieważ może to prowadzić do nieprawidłowego przygotowania powierzchni elektrody. Jeśli MEA nie jest całkowicie sucha, kropla lamininy rozprzestrzeni się po naczyniu, co może utrudnić odpowiednią lokalizację komórek nad elektrodami podczas wysiewania. Ten etap jest bardzo delikatny i może doprowadzić do uszkodzenia powierzchni MEA w przypadku niestabilnej ręki lub braku uwagi.
- W tym momencie na MEA nakłada się pokrywki teflonowe, aby zapobiec parowaniu lamininy. Zakładanie pokrywki również wymaga ostrożności. Pokrywkę należy nakładać lub zdejmować tylko wtedy, gdy MEA znajduje się na całkowicie płaskiej powierzchni. W przeciwnym razie dodatkowe siły wywierane przez nierówną powierzchnię mogą spowodować pęknięcie szklanego dna matrycy, czyniąc ją niezdatną do użytku. Następnie naczynie umieszcza się w inkubatorze na 20 minut.
- Podczas wiązania lamininy z naczyniem, stożkową probówkę 15 ml z komórkami wyjmuje się z wirówki i przenosi z powrotem do komory z laminarnym przepływem powietrza. Na dnie probówki powinien być widoczny osad. Nadosad ostrożnie usuwa się sterylną plastikową pipetą serologiczną 5 ml. Nadosad należy zachować na wypadek, gdyby proces wirowania był niepełny. Osad resuspensuje się następnie delikatnie poprzez tryturację pipetą P-1000 lub krótkie wortexowanie w 300-500 μl pożywki komórkowej, w zależności od oczekiwanej wydajności. 10 μl zawiesiny komórkowej pobiera się i nanosi na komorę contamos (hemacytometr), aby określić stężenie komórek. Jeśli wydajność jest niska, analizuje się nadosad pod mikroskopem, aby sprawdzić, czy etap wirowania był niepełny. Może być konieczne powtórzenie wirowania. Jeśli wydajność jest wysoka, konieczne może być rozcieńczenie dla dokładniejszego zliczenia. Gęstość wysiewu komórek może wynosić od 5 000 do 300 000 komórek na MEA. Należy obliczyć rozcieńczenie tak, aby pożądana liczba komórek do wysiewania znajdowała się w objętości końcowej 15-20 μl. Zazwyczaj stosujemy końcowe stężenie od 1000 do 3000 komórek na μl. Jedna para kor zachowuje zazwyczaj od 10 do 15 milionów komórek. Liczba ta może być nieco niższa w przypadku zastosowania tryturacji.
- Do tego czasu inkubacja lamininy na MEA powinna być zakończona. Zdejmuje się pokrywkę teflonową z MEA i większość kropli lamininy aspiruje próżniowo lub usuwa pipetą. Następnie 15-20 μl pożądanej zawiesiny komórkowej natychmiast nanosi się na pozostały wilgotny obszar lamininy. Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do tej niewielkiej objętości zawiesiny komórkowej, ponieważ pęcherzyki powietrza mogą uniemożliwić równomierne pokrycie wszystkich elektrod przez komórki. Delikatnie zakłada się pokrywkę i ostrożnie umieszcza MEA z powrotem w inkubatorze na 30 minut. Następnie naczynie ogląda się pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że komórki przylgnęły i pokrywają wszystkie elektrody. Jeśli nie wszystkie elektrody są pokryte, można dodać więcej komórek i ponownie umieścić MEA w inkubatorze z założoną pokrywką, aby umożliwić przyleganie nowym komórkom. Jeśli probówka z zawiesiną komórkową jest używana po kilku minutach od pozostawienia jej w spoczynku, należy ją delikatnie zakręcić, aby zresuspensować osadzone komórki. Po osiągnięciu odpowiedniego pokrycia elektrod naczynie powoli zalewa się 1 ml ciepłej (35-37°C) pożywki komórkowej. Zakłada się pokrywkę teflonową i umieszcza naczynie z powrotem w inkubatorze. Komora z laminarnym przepływem powietrza może szybko wysuszyć małe objętości lamininy i zawiesiny komórkowej po naniesieniu na MEA, dlatego należy dbać o to, aby były one zamknięte pokrywkami teflonowymi. Idealne środowisko inkubatora dla zamkniętych MEA to 5% CO2, 9% O2 i 65% wilgotności w temperaturze 35-37°C. Niskie ciśnienie tlenu jest ważne dla długoterminowych kultur, ponieważ zmniejsza uszkodzenia oksydacyjne.12 Utrzymywanie 65% wilgotności ogranicza parowanie przez membranę teflonową (w porównaniu do braku kontroli wilgotności) i pozwala na stosowanie elektroniki MEA w inkubatorze bez ryzyka uszkodzeń spowodowanych kondensacją wody (co zdarza się w normalnych inkubatorach nawilżonych do nasycenia).
D. Wymiana medium komórkowego i pielęgnacja kultur dysocjowanych na MEA
- Dzień po wysianiu komórek należy sprawdzić MEA pod mikroskopem świetlnym. Jeśli kolor pożywki jest nadal brzoskwiniowy lub czerwony, a ilość zanieczyszczeń komórkowych i martwych komórek jest niewielka, pierwszą wymianę pożywki można odłożyć o kolejny dzień. Jeżeli jednak pożywka zaczyna przybierać kolor pomarańczowy lub żółty i/lub występuje duża ilość zanieczyszczeń komórkowych i martwych komórek, należy wymienić pożywkę. Wszystkie wymiany pożywki powinny odbywać się w standardowej laminarnej komorze do hodowli komórek.
- Pierwsza wymiana pożywki polega na zdjęciu pokrywki MEA, odessaniu całej pożywki z naczynia, zastąpieniu usuniętej objętości świeżą pożywką komórkową, a następnie ponownym założeniu pokrywki. Podczas pierwszej wymiany należy zastąpić całą objętość pożywki komórkowej, aby usunąć wszelkie pozostałości zanieczyszczeń komórkowych powstałe podczas procesu wysiewania. Kolejne wymiany pożywki powinny polegać jedynie na odessaniu około połowy pożywki, a następnie uzupełnieniu usuniętej objętości świeżą pożywką. Pozwala to na zachowanie części czynników wzrostu wydzielonych do pożywki komórkowej, co zapewnia bardziej optymalne środowisko wzrostu. Jeśli dolna strona pokrywki zostanie zanieczyszczona podczas procesu wymiany pożywki lub jeśli pokrywka wykazuje oznaki uszkodzenia bądź niedopasowania, należy użyć nowej, autoklawowanej pokrywki. Pożywkę komórkową można przechowywać w inkubatorze w sterylnym pojemniku z odpowiednio zmodyfikowaną pokrywką (posiadającą membranę z teflonu (fluorowanego etylenu-propylenu), która umożliwia wymianę gazową). Pożywkę komórkową można również przechowywać w temperaturze 4°C, jednak przed wymianą należy ją ogrzać i doprowadzić do stanu równowagi w inkubatorze.
- Około dwa razy w tygodniu należy usunąć i zastąpić około połowy pożywki w naczyniu. W przypadku niektórych preparatów komórkowych może dojść do szybszej zmiany barwy pożywki, co wymusza częstsze wymiany. Jeśli zauważony zostanie żółty kolor pożywki, należy wymienić jej całą objętość. Szybka zmiana barwy na żółtą może być również oznaką kontaminacji, dlatego należy sprawdzić naczynie pod mikroskopem świetlnym pod kątem wizualnych oznak infekcji.
- W zależności od warunków eksperymentalnych i zachowania zasad sterylności, starannie pielęgnowane kultury mogą przetrwać ponad rok.1
E. Rejestracja sygnałów z MEA
- Każda MEA posiada 59 elektrod rejestrujących i jedną wewnętrzną elektrodę uziemiającą. Dostępnych jest kilka komercyjnych systemów rejestracji, a także wersje wykonane na zamówienie. Dostawcy obejmują Multi-Channel Systems, Tucker Davis Technologies, Axion Biosystems, Alpha Med Scientific MED64, Plexon, Ayanda Biosystems oraz BioLogic. Nasze laboratorium obecnie wykorzystuje komercyjny zestaw firmy Multi-Channel Systems, system oparty na systemie Windows zaprojektowany na zamówienie o nazwie NeuroRighter15 oraz system oparty na systemie Linux zaprojektowany na zamówienie o nazwie MeaBench16. Każdy z tych systemów umożliwia rejestrację z MEAs (Multi-Channel Systems) przy użyciu przedwzmacniacza Multi-Channel Systems. Stosowany jest również komercyjny zestaw firmy Tucker Davis Technologies. Niniejszy protokół zademonstruje rejestrację z MEAs za pomocą NeuroRighter. Oprogramowanie NeuroRighter jest otwartoźródłowe i dostępne do bezpłatnego pobrania wraz z projektami sprzętowymi w grupach Google NeuroRighter. (http://sites.google.com/site/neurorighter/)
- Hodowle na MEAs potrzebują 2-3 tygodni, aby osiągnąć stabilny stan aktywności.17,18 Aktywność ta obejmuje spontaniczne potencjały czynnościowe oraz rozładowania w całej hodowli (serię potencjałów czynnościowych rozprzestrzeniających się synaptycznie w całej hodowli). Jednak charakter eksperymentu określi optymalną liczbę dni in vitro przed rozpoczęciem rejestracji.
- Aktywność neuronalna zależy od optymalnych warunków środowiskowych, w tym temperatury i pH.1 W związku z tym nasza rejestracja odbywa się w inkubatorze, zgodnie z opisem powyżej. W przypadku planowania krótkich eksperymentów (<30 minut), dostępny jest również komercyjny moduł grzewczy, który można podłączyć do przedwzmacniacza MCS w celu utrzymania optymalnej temperatury MEA.
- Aby rozpocząć rejestrację, MEA (nadal w szalce Petriego) należy delikatnie przenieść z inkubatora do przechowywania do inkubatora rejestracyjnego. Dno szalki powinno pozostać równolegle do podłoża. Należy unikać gwałtownych ruchów lub wstrząsów MEA, ponieważ mogą one spowodować oddzielenie hodowli od podłoża. Następnie MEA wyjmuje się z szalki Petriego i umieszcza w przedwzmacniaczu rejestrującym. Dopasuj wewnętrzną elektrodę uziemiającą w szalkach, które obecnie demonstrujemy, do elektrody uziemiającej w przedwzmacniaczu (kanał CR15 dla przedwzmacniacza MCS). Przetrzyj styki wokół obwodu MEA chusteczką lub patyczkiem watnym zwilżonym 70% etanolem, aby usunąć odciski palców lub inne zanieczyszczenia, które mogą utrudnić dobre połączenie. Po upewnieniu się, że MEA jest prawidłowo osadzona, pokrywę przedwzmacniacza należy opuścić i zablokować. Styki na pokrywie przedwzmacniacza powinny ściśle przylegać do pól kontaktowych elektrod na MEA. Wizualnie sprawdź wyrównanie styków i w razie potrzeby skoryguj je patyczkiem watnym. Umieść przedwzmacniacz na urządzeniu Peltiera w inkubatorze. Składa się ono z dwóch miedzianych płyt z termoelektryczną pompą ciepła Peltiera umieszczoną pomiędzy nimi. Uruchamiamy to urządzenie przy napięciu około 5V, aby odprowadzić część ciepła generowanego przez układ przedwzmacniacza. Zapobiega to kondensacji pary wodnej wewnątrz teflonowej pokrywy membranowej. Każda kondensacja mogłaby zaszkodzić hodowli poprzez zwiększenie osmolarity medium w kontakcie z komórkami na skutek odparowania. Dzięki zapewnieniu, że przedwzmacniacz i medium znajdują się o jeden lub dwa stopnie poniżej temperatury powietrza w inkubatorze, zmiany osmolarity są minimalizowane.
- Włącz zasilanie NeuroRighter i uruchom oprogramowanie na stacji roboczej. Dostosuj ustawienia NeuroRighter do warunków in vitro, wprowadzając odpowiednie konfiguracje programowe i sprzętowe. Wybierz liczbę elektrod w oprogramowaniu. Aby zmniejszyć poziom szumu tła, można włączyć cyfrowy filtr pasmowoprzepustowy. Wybierz plik danych z włączonym przełącznikiem zapisu, jeśli dane mają zostać zapisane do późniejszej analizy. Aktywuj przycisk start po wyborze wszystkich odpowiednich ustawień.
- Na ekranie powinny pojawić się bieżące ślady aktywności i szumu tła. Powinny być widoczne sporadyczne potencjały czynnościowe oraz rozładowania aktywności w całej szalce. W poniższej sekcji dotyczącej rozwiązywania problemów z rejestracją z MEAs omówiono kilka powszechnych problemów w przypadku, gdy oczekiwana aktywność nie jest widoczna.
- Widok ekranu można zmienić na tryb detekcji impulsów (karta „Spk Wfms”), w którym potencjały czynnościowe są wyświetlane statycznie w miarę ich występowania w oknach czasowych 3ms. Dla danego kanału rzeczywiste zewnątrzkomórkowe potencjały czynnościowe powinny trwać około 1ms i powinny być generowane wielokrotnie w tym samym kierunku (dodatnim lub ujemnym). Czasami na tej samej elektrodzie mogą być widoczne dwa lub więcej neuronów o różnych polaryzacjach. Impulsy o krótkim przebiegu czasowym i zmiennej polaryzacji są prawdopodobnie artefaktami. Rysunek 1 przedstawia wykres rastrowy danych impulsowych.
- Widok ekranu można zmienić na potencjały polowe (LFP), aby spróbować zlokalizować źródło aktywności rozładowań. Ten rodzaj ustawień może być bardziej użyteczny podczas rejestracji in vivo, ponieważ hodowle monowarstwowe mają słabe LFP. Należy zauważyć, że niektóre przedwzmacniacze (w tym ten, którego używamy z firmy Multi-Channel Systems) posiadają filtry górnoprzepustowe przy 10 Hz, które tłumią rytmy LFP o niższej częstotliwości.
F. Stymulacja sieci neuronalnych na MEA
- Tych samych 59 elektrod rejestrujących na MEA można również użyć do stymulacji hodowli. Zakres stymulacji będzie zależał od charakteru eksperymentu. NeuroRighter zapewnia elastyczność w projektowaniu eksperymentów stymulacyjnych, ponieważ opiera się na kodzie open source.15
- Wyzwanie przy stymulacji hodowli polega na tym, że bodziec generuje artefakt, który może trwać kilka milisekund. Artefakt ten może być na tyle duży, aby wywołać detekcję kolca i przesłonić odpowiedzi na bodziec. NeuroRighter wykorzystuje algorytm SALPA w celu zminimalizowania, a w niektórych przypadkach praktycznego wyeliminowania artefaktu stymulacyjnego.19
- Aby stymulować sieć neuronalną na MEA, należy przeszkolić algorytm SALPA w zakładce „Recording settings”, aby ograniczyć artefakt stymulacyjny. Aktywuj SALPA w zakładce „Online Settings”. Wybierz nazwę pliku i kliknij przycisk Start, tak jak poprzednio, aby rozpocząć rejestrację. Następnie kliknij zakładkę „Stim”. Na tej stronie dostępnych jest wiele opcji konfiguracji stymulacji.
- Prostym eksperymentem jest stymulacja jednej elektrody i obserwacja reaktywności naczynia przy użyciu sekcji „Open loop”. Wybierz częstotliwość, napięcie, szerokość fazy oraz numer kanału. Naciśnij przycisk start w sekcji open loop. Odpowiedzi na tę stymulację można wizualizować w głównej zakładce „Spikes” oraz zakładce „Spk Wfms” i analizować w plikach danych.
- W czasie rzeczywistym można wizualizować serie wyładowań w sposób zsynchronizowany czasowo z bodźcem o częstotliwości 1 Hz i napięciu 0.5V przyłożonym do wielu elektrod. Rycina 2 przedstawia wykres rastrowy odpowiedzi po stymulacji. Wcześniejsze obserwacje wykazały istnienie dwóch różnych typów aktywności wywołanej bodźcem: potencjałów czynnościowych wywołanych bezpośrednio (dAPs) oraz potencjałów czynnościowych wywołanych synaptycznie (sAPs).20
- Neurony w hodowli wykazują spontaniczne serie aktywności. W niektórych eksperymentach ten rodzaj wyładowań może utrudniać próbę kontrolowania dynamiki sieci. Co ciekawe, rozproszona stymulacja z częstotliwością 1-2 Hz na elektrodę może zacząć tłumić aktywność seryjną w sieci neuronalnej na MEA.21
G. Rozwiązywanie problemów z rejestracją z MEA
- Brak potencjałów czynnościowych lub wyładowań seryjnych w MEA po włączeniu oprogramowania:
- Czy kultura jest wystarczająco stara? Potencjały czynnościowe powinny być widoczne pod koniec pierwszego tygodnia in vitro. Wyładowania seryjne występują około dwóch do trzech tygodni in vitro.
- Czy sprzęt jest zasilany? System NeuroRighter wykorzystuje dwa akumulatory ołowiane 6V do zasilania sprzętu. Przełącznik zasilania musi znajdować się w pozycji włączonej, a akumulatory muszą być naładowane.
- Czy kultura żyje? Czasami może być to trudne do ustalenia, zwłaszcza w gęstych lub starszych kulturach ze względu na przerost komórek glejowych. Można jednak szukać zdrowo wyglądających neuronów (błyszczące, eliptyczne ciała komórkowe w mikroskopii kontrastowej) i nienaruszonych (niepofragmentowanych) wypustek komórkowych. Problemem z kulturą może być również widoczne zanieczyszczenie lub szybka degradacja medium (zakwaszenie już po 1 do 2 dniach między zmianami medium).
- Jaka jest impedancja elektrod? W wyniku wielokrotnego użytkowania mikroelektrody lub izolacja MEA mogą ulec degradacji. NeuroRighter posiada funkcję oceny impedancji elektrod.15 Normalne odczyty impedancji przy około 1kHz powinny mieścić się w zakresie od 10 000 do 100 000 Omów. Wyższa impedancja sugeruje przerwanie przewodów lub uszkodzenie elektrod, a odczyty poniżej 10 000 Omów sugerują nieszczelną izolację.
- Czy przedwzmacniacz jest podłączony do płyty sprzętowej? Przedwzmacniacz powinien posiadać kabel wyjściowy łączący go z płytą sprzętową. Przedwzmacniacz posiada również 4 małe płytki stymulatora, które również łączą się z główną płytą sprzętową i są istotne wyłącznie w przypadku stymulacji.
- Czy zmieniono ustawienia oprogramowania NeuroRighter? Ustawienia konfiguracji sprzętu w oprogramowaniu muszą być poprawne, aby rejestracja działała. Może to być spowodowane instalacją zaktualizowanych wersji lub zmianą ustawień przez wielu użytkowników.
- Czy MEA znajduje się w temperaturze 35-37°C? Niższe temperatury mogą prowadzić do zmniejszenia spontanicznej aktywności w sieciach korowych. Zazwyczaj nie jest to problem, ponieważ rejestracja odbywa się w inkubatorze z kontrolowaną temperaturą, jednak należy odczekać do wyrównania temperatury, jeśli MEA znajdowało się poza inkubatorem dłużej niż kilka sekund.
- Czy medium było zmieniane w ciągu ostatnich kilku godzin? Zaobserwowaliśmy, że kultury często przestają generować wyładowania na kilka godzin po dokarmieniu. Dlatego najlepiej jest przeprowadzać eksperymenty przed dokarmieniem.
- Elektroda z nadmiernym szumem tła nasycającym okno rejestracji:
- Czy styk pinu przedwzmacniacza z elektrodą na MEA jest wystarczający? Problem ten może być spowodowany źle dopasowanym pinem w pokrywie przedwzmacniacza, małym zanieczyszczeniem, kroplą medium, zdegradowaną powierzchnią elektrody lub nachodzącą przezroczystą membraną z pokrywy. Pierwszym krokiem jest sprawdzenie styku pod kątem tych problemów. Poprawienie ułożenia pinu za pomocą patyczka higienicznego nasączonego 70% etanolem może czasami poprawić styk, szczególnie jeśli należało usunąć kroplę medium. Sygnał może wydawać się gorszy do momentu odparowania etanolu.
- Czy elektroda wydaje się być uszkodzona? Obrazowanie pod mikroskopem świetlnym może czasami ujawnić pęknięcia lub wżery w izolacji elektrody, co prowadzi do tego rodzaju artefaktów.
- Czy pady kontaktowe są zużyte lub porysowane? Czasami na MEA może znajdować się kilka styków elektrod, które są trudne do zoptymalizowania. Jest to częstsze po wielokrotnym użyciu i obsiewaniu MEA. Gumowy dystans impregnowany złotym drutem przewodzi tylko w kierunku swojej grubości 0.5mm i może poprawić styk pinu przedwzmacniacza z MEA. Materiał ten jest dostępny w firmie Fujipoly i może być docięty do rozmiarów MEA i pokrywy.
- Całe MEA wykazuje nadmierny szum tła:
- Czy MEA jest ustawione w odpowiedniej orientacji, aby elektroda uziemiająca na MEA stykała się z pinem uziemiającym przedwzmacniacza? Jeśli MEA jest w prawidłowej orientacji, należy również rozważyć kwestię braku problemów ze stykiem uziemienia (punkty 2 a-c powyżej). Czy kanał CR15 jest uziemiony krótkim przewodem do obudowy przedwzmacniacza? Użycie zworki do uziemienia poprzez wewnętrzne rezystory 30 kOhm może skutkować nadmiernym szumem.
- Czy występują zakłócenia z okolicznego oświetlenia, źródeł zasilania lub innych urządzeń? Jedną z najczęstszych form zakłóceń jest szum 60 Hz pochodzący z lamp i urządzeń. System rejestrujący musi być prawidłowo uziemiony. Ekranowanie odsłoniętych kabli może również pomóc w redukcji zakłóceń tła.
Reprezentatywne wyniki
Rycina 1.Jest to wykres rastrowy 2 minut spontanicznej aktywności sieci neuronalnej. Każda czarna kropka reprezentuje potencjał czynnościowy. Dwie serie wyładowań (bursts) zostały zaznaczone niebieskimi strzałkami. Odpowiedź zarejestrowana na wielu elektrodach jest funkcją łączności sieci.
Rysunek 2.Przedstawiono wykres rastrowy 16 sekund aktywności wywołanej bodźcem. Czerwone gwiazdki reprezentują bodźce. Czerwone strzałki wskazują pięć bodźców, które skutecznie wywołały serie aktywności synaptycznej na wielu elektrodach. Sporadycznie bodziec nie wywołuje serii, co pokazano tutaj przy niebieskiej strzałce.
Dyskusja
Protokół ten zawiera instrukcje dotyczące hodowli i utrzymania sieci neuronowych na układach mikroelektrod, a także wprowadzenie do rejestrowania i stymulowania sieci neuronowych. Niektóre z najczęstszych problemów podczas nagrywania z MEA zostały również omówione w sekcji Rozwiązywanie problemów z MEA. Od czasu do czasu występują różnice w protokole, jak omówiono w całym tekście, i często zmiany te są wykorzystywane do optymalizacji określonych warunków wymaganych przez niektóre projekty eksperymentalne.
Chociaż prezentowany tutaj system nagrywania i stymulacji składa się z naszego specjalnie zaprojektowanego NeuroRighter15 z przedwzmacniaczem MCS, istnieje wiele innych systemów, które mogą zapewnić interfejs z sieciami neuronowymi. Wybór konkretnej konfiguracji będzie zależał od konkretnych potrzeb eksperymentalnych.
W tym protokole przedstawiono uproszczone przykłady rejestracji i stymulacji, jednak te kultury na MEA mogą być wykorzystane do uzyskania wglądu w złożone pytania dotyczące aktywności synaptycznej i połączeń sieci neuronowych. Jak wspomniano powyżej, trwają prace nad wykorzystaniem tej technologii do badania procesów takich jak plastyczność komórkowa, rozwój, ekscytotoksyczność i neurodegeneracja. 6-10 Na przykład niedawna publikacja z naszego laboratorium wykazała powtarzalne uczenie się ukierunkowane na cel in vitro ze stymulacją w pętli zamkniętej w czasie rzeczywistym w odpowiedzi na aktualną aktywność sieci neuronalnej3.
Chociaż kultury MEA są często wybredne i delikatne, dzięki swojej prostocie i dostępności (w porównaniu z nienaruszonymi zwierzętami) stanowią potężny model do badania aktywności neuronalnej na poziomie sieci.
Oświadczenia
CMH nie ma nic do ujawnienia.
JDR i SMP są płatnymi konsultantami dla Axion Biosystems.
Opłaty za zgłoszenie i opłaty za przetwarzanie wideo dla tego artykułu i filmu zostały łaskawie sponsorowane przez Multi-Channel Systems.
JDR i SMP są płatnymi konsultantami dla Axion Biosystems.
Opłaty za zgłoszenie i opłaty za przetwarzanie wideo dla tego artykułu i filmu zostały łaskawie sponsorowane przez Multi-Channel Systems.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować członkom grupy Potter za dostarczenie bezcennych komentarzy na temat protokołu. Praca ta została sfinansowana ze stypendium szkoleniowego w zakresie badań klinicznych od Fundacji Amerykańskiej Akademii Neurologii dla CMH, stypendium z Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych (NIGMS; http://www.nigms.nih.gov/) do JDR (GM08169), grant z NIH National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS054809), Ruth L. Kirschstein National Research Service Award dla JDR (NS060392), grant NSF EFRI (0836017), Coulter Foundation Translational Research Award oraz stypendium badawcze dla JDR (NS007480).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |||||||||||||||||||||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Kieszonkowe materiały
Sprzęt:
Roztwory i odczynniki: BSA solution: Cell Medium: Roztwór separacyjny do przygotowania roztworu papainy:23
To rozwiązanie można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w 4° C przez kilka miesięcy. DNAse I: Hank' s zrównoważony roztwór soli: Hibernate solution: roztwór Lamininy: Papaina roztwór:23 Roztwór polietylenoiminy (PEI):13 Sterylna woda dejonizowana: Trypsin (0,25% z EDTA, Gibco 25200): |
Bibliografia
- Potter, S. M., DeMarse, T. B. A new approach to neural cell culture for long-term studies. J Neurosci Methods. 110, 1-2 (2001).
- Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability. J Neurosci Methods. 180, 243-254 (2009).
- Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. Spatio-temporal electrical stimuli shape behavior of an embodied cortical network in a goal-directed learning task. J Neural Eng. 5, 310-323 (2008).
- Shahaf, G., Marom, S. Learning in networks of cortical neurons. J Neurosci. 21, 8782-8788 (2001).
- Wagenaar, D. A., Nadasdy, Z., Potter, S. M. Persistent dynamic attractors in activity patterns of cultured neuronal networks. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 73, 051907-05 (2006).
- Esposti, F., Signorini, M. G., Potter, S. M., Cerutti, S. Statistical long-term correlations in dissociated cortical neuron recordings. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 17, 364-369 (2009).
- Madhavan, R., Chao, Z. C., Potter, S. M. Plasticity of recurring spatiotemporal activity patterns in cortical networks. Phys Biol. 4, 181-193 (2007).
- Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. Network plasticity in cortical assemblies. Eur J Neurosci. 28, 221-237 (2008).
- Hofmann, F., Bading, H. Long term recordings with microelectrode arrays: studies of transcription-dependent neuronal plasticity and axonal regeneration. J Physiol Paris. 99, 2-3 (2006).
- Gortz, P. Transient reduction of spontaneous neuronal network activity by sublethal amyloid beta (1-42) peptide concentrations. J Neural Transm. 116, 351-355 (2009).
- Koito, H., Li, J. Preparation of rat brain aggregate cultures for neuron and glia development studies. J Vis Exp. 31, (2009).
- Brewer, G. J., Cotman, C. W. Survival and growth of hippocampal neurons in defined medium at low density: advantages of a sandwich culture technique or low oxygen. Brain Res. 494, 65-74 (1989).
- Lelong, I. H., Petegnief, V., Rebel, G. Neuronal cells mature faster on polyethyleneimine coated plates than on polylysine coated plates. J Neurosci Res. 32, 562-568 (1992).
- Potter, S. M., Pine, J., Fraser, S. E. Neural transplant staining with DiI and vital imaging by 2-photon laser-scanning microscopy. Scanning Microsc Suppl. 10, 189-199 (1996).
- Rolston, J. D., Gross, R. E., Potter, S. M. A low-cost multielectrode system for data acquisition enabling real-time closed-loop processing with rapid recovery from stimulation artifacts. Front Neuroengineering. 2, (2009).
- Wagenaar, D. A., Potter, S. M. A versatile all-channel stimulator for electrode arrays, with real-time control. J Neural Eng. 1, 39-45 (2004).
- van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks. IEEE Trans Biomed Eng. 51, 2051-2062 (2004).
- Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures. BMC Neurosci. 7, (2006).
- Wagenaar, D. A., Potter, S. M. Real-time multi-channel stimulus artifact suppression by local curve fitting. J Neurosci Methods. 120, 113-120 (2002).
- Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. Long-term activity-dependent plasticity of action potential propagation delay and amplitude in cortical networks. PLoS One. 3 (5), e2088-e2088 (2008).
- Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation. J Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).
- Jimbo, Y., Tateno, T., Robinson, H. P. Simultaneous induction of pathway-specific potentiation and depression in networks of cortical neurons. Biophys J. 76 (2), 670-678 (1999).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing nerve cells. , 2nd ed, MIT Press. Cambridge, Mass. (1998).
Przedruki i uprawnienia
