Reakcja odwrotnej transkrypcji
Ustaw temperaturę bloku grzejnego na 70-80°C oraz 42°C. Na tym etapie można również zastosować łaźnie wodne. W przypadku użycia bloków grzejnych, należy dodać niewielką ilość wody, aby zapewnić równomierny rozkład ciepła.
- Reakcja inicjująca
- Odmierzyć 3 μg RNA
- Dopełnić objętość do 13 μl wodą wolną od RNaz
- Dodać 2,5 μl randomowych starterów heksamerowych (2mg/mL)
- Dokładnie wymieszać i inkubować w temperaturze 70-80°C przez 8 minut. Następnie umieścić na lodzie na 5 min.
- Przygotować koktajl RT (14,5 μl/reakcję):
Składnik Objętość Bufor 5X First Strand 6 µl 0,1 M DTT 3 µl Mieszanka 25X aminoallyl-dNTP 1,2 µl SuperScript II RT (200U/µl) 2,3 µl Woda 2,0 μl
* Dla n reakcji przygotować Master Mix dla n+0,5 aliquotów koktajlu, aby uniknąć ich zabraknięcia. - Dodać 14,5 μl do schłodzonych reakcji.
- Wymieszać (nie wirować w vortexie) i inkubować w temperaturze 42°C przez 3-4 godziny
- Próbki można przechowywać w temperaturze -20°C, jeśli jest to konieczne.
Hydroliza RNA
- Do każdej próbki dodać 3 µl 1 N NaOH oraz 0,6 µl 0,5 M EDTA. (Stężenia końcowe = 100mM NaOH, 10mM EDTA)
- Wymieszać i inkubować w temperaturze 65°C przez 10 minut.
- Zneutralizować, dodając 33,6 μl 1M HEPES, pH=7,0 (stężenie końcowe = 500mM HEPES)
- W razie potrzeby próbki można przechowywać w temperaturze -20°C.
Oczyszczanie reakcji: Usuwanie nieprzyłączonego aa-dUTP i wolnych amin
Uwaga: Niniejszy protokół oczyszczania został zmodyfikowany na podstawie instrukcji zestawu Qiagen QIAquick PCR purification kit. Bufor do płukania fosforanowego oraz bufor do elucji zostały zastąpione zamiennikami, ponieważ bufory dostarczone przez firmę Qiagen zawierają wolne aminy, które konkurują z reakcją sprzęgania barwnika Cy. Można również wykorzystać kolumny z zestawu do mini-preparacji.
- Wymieszać reakcję cDNA z 300 µl (lub 5-krotną objętością reakcji = 336 μl) buforu PB (dostarczonego przez Qiagen) i przenieść do kolumny QIAquick.
- Umieścić kolumnę w probówce do zbierania o pojemności 2 ml (dostarczonej przez Qiagen) i wirować przy ~13 000 rpm przez 1 minutę. Opróżnić probówkę do zbierania.
- Aby przeprowadzić przemycie, dodać do kolumny 750 µl fosforanowego buforu do przemywania (nie firmy Qiagen) i wirować przy ~13 000 rpm przez 1 minutę.
- Opróżnić probówkę do zbierania i powtórzyć etap przemywania 750 µl oraz wirowania.
- Opróżnić probówkę do zbierania i wirować kolumnę przez dodatkową 1 minutę z maksymalną prędkością.
- Przenieść kolumnę do nowej probówki do mikrowirowania o pojemności 1,5 mL i ostrożnie dodać 30 µl fosforanowego buforu do elucji (patrz sekcja przygotowania roztworów).
- Inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
- Eluować poprzez wirowanie przy ~13 000 rpm przez 1 minutę.
- Przeprowadzić drugą elucję (z użyciem kolejnych 30 µl fosforanowego buforu do elucji) do tej samej probówki, powtarzając kroki 6-8. Końcowa objętość eluatu powinna wynosić ~60 µl.
- Ilość cDNA można określić na tym etapie:
ng cDNA = (czynnik rozcieńczenia)(OD260)(37)(całkowita objętość eluatu z kolumny) - Osuszyć próbkę w wirówce próżniowej (speed vac) w temperaturze 45°C.
- W razie potrzeby próbki można przechowywać w temperaturze -20°C.
Sprzęganie aa-cDNA z estrem barwnika Cy
- W razie potrzeby resuspendować cDNA znakowane aminoallylem w 10 μl 50 mM wodorowęglanu sodu, pH=9.0. (Bufor ten należy przygotowywać na świeżo co dwa tygodnie)
- Pracując w ciemności, dodać sondę do probówki z odpowiednim barwnikiem Cy. Kilkukrotnie pipetować w górę i w dół, aby resuspendować barwnik.
- Inkubować mieszaninę reakcyjną przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze pokojowej. (Inkubacja może trwać do dwóch godzin)
Oczyszczanie produktów reakcji II: Usuwanie nieprzypiętego barwnika
- Do mieszaniny reakcyjnej dodać 35 µl 100 mM NaOAc pH 5.2. Dokładnie wymieszać.
- Do każdej próbki dodać 250 µl (lub 5-krotność objętości reakcji = 225 μl) buforu PB (dostarczonego przez Qiagen) i wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół.
- Umieścić kolumnę wirówkową QIAquick w probówce zbiorczej o pojemności 2 mL (dostarczonej przez Qiagen), nanieść próbkę na kolumnę i wirować przy ~13,000 przez 1 minutę. Opróżnić probówkę zbiorczą.
- W celu przemycia dodać do kolumny 0,75 mL buforu PE (dostarczonego przez Qiagen) i wirować przy ~13,000 przez 1 minutę.
- Powtórzyć krok 4.
- Opróżnić probówkę zbiorczą i wirować kolumnę przez dodatkową 1 minutę z maksymalną prędkością.
- Umieścić kolumnę w czystej probówce do mikrowirowania o pojemności 1,5 mL i ostrożnie dodać 30 µl buforu EB (dostarczonego przez Qiagen) na środek membrany kolumny.
- Inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
- Eluować poprzez wirowanie przy ~13,000 rpm przez 1 minutę.
- Przeprowadzić drugą elucję do tej samej probówki, powtarzając kroki 7-9. Końcowa objętość eluatu powinna wynosić ~60 µl.
Analiza reakcji znakowania
Ilość cDNA i znacznika może zostać określona na tym etapie:
- Zmierz OD 260, 550 oraz 650 (próbka ślepa to woda). Użyj programu nanodrop microarray.
- Oblicz pmol wbudowanych barwników, pmol DNA oraz stosunek nuc/dye, korzystając z poniższych równań:
pmol nukleotydów = [OD260 * objętość (μL) * 37 ng/μL * 1000 pg/ng] / 324.5 pg/pmol
Uwaga: 1 OD260 = 37 ng/μL dla cDNA; 324,5 pg/pmol średnia masa cząsteczkowa dNTP)
pmol Cy3 = OD550 * objętość (μL)/0,15
pmol Cy5 = OD650 * objętość (μL)/0,25
stosunek nukleotydów do barwnika = pmol cDNA/pmol barwnika Cy
Jeśli używasz urządzenia NanoDrop, otrzymujesz ono już wynik w pmol/μl dla każdego barwnika. Aby obliczyć całkowitą ilość wbudowanego barwnika w pmol, wystarczy pomnożyć tę wartość przez objętość.
Uwaga: >150-200 pmol wbudowanego barwnika na próbkę oraz stosunek mniejszy niż 20 nukleotydów/cząsteczek barwnika są optymalne dla hybrydyzacji.
- Próbki można przechowywać w temperaturze -20°C w ciemności.
- Połączyć sondy przeznaczone do wspólnej hybrydyzacji i odparować w wirówce do odparowywania (speedvac) w temperaturze 42°C.
- Próbki można przechowywać w temperaturze -20°C do momentu przystąpienia do hybrydyzacji.
Preparaty do prehybrydyzacji
- Umieść preparat stroną roboczą do dołu w czystym czerwonym uchwycie do szkiełek w 100 mL wody w temperaturze RT na 3-5 minut
- Wysusz gwałtownie preparat, kładąc go stroną roboczą do góry na bloku grzewczym o temperaturze 100°C przez kilka sekund – aż do momentu zniknięcia kondensacji
- Przeprowadź sieciowanie UV preparatu dawką 250 mJoules (wprowadź wartość 2500 do urządzenia do sieciowania UV)
- Nawodnij preparaty, zanurzając je w uprzednio ogrzanej wodzie o temperaturze 42°C. Wirować przez 5 min przy 700 RPM w temperaturze RT.
- Inkubuj preparaty w 50-mililitrowej kasecie Coplina zawierającej uprzednio ogrzany bufor do prehybrydyzacji (5XSSC, 1% BSA, 0,1% SDS) przez co najmniej 45 minut w 42°C; w razie potrzeby czas inkubacji można wydłużyć.
50 mL buforu do prehybrydyzacji: 12,5 mL 20x SSC, 10 ml 5% BSA, 0,5 ml 10 % SDS, 27 mL wody - Zanurz preparaty w uprzednio ogrzanej wodzie (42°C) i agituj przez kilka minut, aby usunąć bufor do prehybrydyzacji.
- Przepłucz w izopropanolu i wirować przez 5 min przy 700 rpm w temperaturze pokojowej w celu osuszenia.
Przygotowanie próbek do hybrydyzacji
- Resuspender sondę w wodzie (objętości podano poniżej)
Dla obj. całkowitej = 30μl Dla obj. całkowitej = 35μl Dla obj. całkowitej = 40μl 19.8 μl wody 23.55 μl wody 27.2 μl wody 1.5 μl 1.5 μl 1.5 μl 10 mg/ml DNA sperm sperm DNA (Invitrogen) 1.2 μl 1.2 μl 1.2 μl 12.5 mg/ml tRNA 4.5 μl 5.25 μl 6 μl 20XSSC (stężenie końcowe 3X) 3 μl 3.5 μl 4 μl 1% SDS
Uwaga: Kolejność dodawania odczynników jest istotna. Nie przygotowywać mieszaniny głównej (master mix). - Gotować przez 5 minut, następnie wirować przez 5 minut przy 14 000 rpm. Chłodzić przez 2 min w temperaturze pokojowej.
Hybrydyzacja
- Do studzienek komory hybrydyzacyjnej, na każdym brzegu oraz w środku, nanieś 10-12 µl 3X SSC.
- Na odpowiednim obszarze slajdu umieść czystą lamellkę dystansową i ostrożnie nanieś roztwór do hybrydyzacji (30-40 μl). Po obu krawędziach lamellki powinna znajdować się nadmiarowa ilość próbki.
- Umieść slajd w komorze. Dokręć śruby i pozostaw w kąpieli wodnej o temperaturze 65°C na noc. Nie kładź komory bezpośrednio na dnie kąpieli wodnej. Na wierzchu najwyższej komory połóż obciążnik, aby ustabilizować cały zestaw. Przykryj kąpiel wodną pokrywą, aby chronić próbki wrażliwe na światło.
Przemywanie hybrydyzacyjne
- Przygotować następujące bufory:
- 1X SSC, 0,05 % SDS
- 0,06 X SSC
- Po inkubacji rozszczelnić komorę do hybrydyzacji. Wyjąć preparat z komory, uważając, aby nie przesunąć szkiełka przykrywnego.
- Aby usunąć szkiełka przykrywne, zanurzyć preparaty w naczyniu zawierającym ciepły bufor piorący 1X SSC, 0,05 % SDS, tak aby szkiełko przykrywne było skierowane w stronę dna naczynia. Szkiełko przykrywne odpadnie po przesunięciu preparatu na boki.
- Po usunięciu szkiełka przykrywnego umieścić preparat w statywie w nowej kąpieli z ciepłym 1X SSC, 0,05% SDS. Mieszać przez kilka minut.
- Przenieść preparaty wraz ze statywem do kąpieli z 0,06 X SSC.
- Przenieść preparaty do kolejnej kąpieli z 0,06 X SSC z nowym statywem, osuszając preparat ręcznikiem papierowym, aby usunąć jak najwięcej buforu zawierającego SDS przed umieszczeniem w nowej kąpieli.
- Mieszać preparaty przez kilka minut.
- Natychmiast wirować w temperaturze pokojowej przez 5 min przy 700 rpm; następnie preparaty są gotowe do skanowania. Przechowywać w ciemności do czasu skanowania.
