Analiza ekspresji genów bakteryjnych za pomocą mikromacierzy

Protocol

Reakcja odwrotnej transkryptazy

Ustaw blok grzewczy na 70-80°C i 42°C. W tym kroku można również użyć kąpieli wodnych. Jeśli używasz bloków grzewczych, wlej trochę wody, aby ciepło było równomierne.

1. Reakcja
   na zalewanie
   1. Weź 3 μg RNA
   2. Dostosuj objętość do 13 μl za pomocą wody wolnej od RNaz
   3. Dodać 2,5 μl losowych starterów heksamerów (2 mg/ml)
2. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 70-80°C przez 8 minut. Następnie ułóż na lodzie na 5 minut.
3. Przygotuj koktajl RT (14,5 μl/ rxn):
   
   składnik

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AA-dUTP		Sigma-Aldrich	A0410	5-(3-aminoallil)-2' deoksyurydyno-5'-trifosforan
dNTP		Amersham	27-2035-01	100 mM dNTP Zestaw
Losowe startery heksamerów	Amersham	27-2166-01	3mg/mL
				L
CyDye™		Amersham	RPN5661	Pakiet barwników reaktywnych po oznakowaniu
QIAquick		Qiagen	28104	Zestaw do oczyszczania PCR
1 M K2HPO4
1 M KH2PO4
M KPO4	Bufor			Aby zrobić 1M bufor fosforanowy (KPO4, pH 8,5-8,7) połącz: 9,5 ml 1M K2HPO4 i 0,5 ml 1M KH2PO4
Bufor do płukania fosforanów	Bufor			Do 100 ml Bufor do płukania fosforanów (5 mM KPO4, pH 8,0, 80% EtOH) mieszać: 0,5 ml 1 M KPO4 pH 8,5 + 15,25 ml wody MilliQ + 84,25 ml 95% etanolu. Bufor do płukania będzie lekko mętny.** WAŻNE: Bufor do płukania fosforanów należy przygotowywać codziennie.
Bufor elucyjny fosforanowy	Bufor			Rozcieńczanie 1 M KPO4, pH 8,5 do 4 mM sterylną wodą
			węglanu sodu	(Na2CO3): 0,5M, pH 9,0. Rozpuścić 4,2 g NaHCO3 w 80 ml sterylnej wody i dostosować pH do 9,0 za pomocą 10 N NaOH; Uzupełnić objętość do 100 ml sterylną wodą. Aby uzyskać 50 mM roztwór do reakcji sprzęgania barwnika, rozcieńczyć wodą w stosunku 1:10. Uwaga: Bufor węglanowy zmienia skład w czasie; Spraw, aby był świeży co kilka tygodni do miesiąca.