W tym filmie i materiałach uzupełniających przedstawiamy protokół przewlekłego obrazowania in vivo nienaruszonego mózgu z wykorzystaniem preparacji z cienkiej czaszki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przewlekłe obrazowanie kory wzrokowej myszy z wykorzystaniem preparatu z pocienioną czaszką
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
In vivo obrazowanie z wykorzystaniem dwufotonowej skaningowej mikroskopii laserowej (2PLSM) umożliwia badanie żywych komórek i wypustek neuronalnych w nienaruszonym mózgu. Przedstawiona tutaj technika pozwala na obrazowanie tego samego obszaru mózgu w kilku punktach czasowych (obrazowanie chroniczne) z rozdzielczością mikroskopową umożliwiającą śledzenie kolców dendrytycznych, czyli niewielkich struktur stanowiących większość postsynaptycznych miejsc pobudzających w OUN. Zdolność do wyraźnego rozdzielania drobnych struktur korowych w wielu punktach czasowych niesie ze sobą wiele zalet, szczególnie w badaniach plastyczności mózgu, w których zmiany morfologiczne w synapsach i przebudowa obwodów mogą pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów podstawowych. W tym filmie i materiałach uzupełniających prezentujemy protokół chronicznego obrazowania in vivo nienaruszonego mózgu z wykorzystaniem preparacji z pocienioną czaszką. Preparacja z pocienioną czaszką jest podejściem małoinwazyjnym, które pozwala uniknąć potencjalnego uszkodzenia opony twardej i/lub kory, redukując tym samym wystąpienie reakcji zapalnej. Przy prawidłowym wykonaniu tego protokołu możliwe jest wyraźne monitorowanie zmian w charakterystyce kolców dendrytycznych w nienaruszonym mózgu przez dłuższy okres czasu.
Protokół
- Aby zwizualizować neurony w nienaruszonym mózgu przy użyciu mikroskopii dwufotonowej, stosuje się preparat, w którym neurony są znakowane markerami fluorescencyjnymi. W prezentowanych tutaj eksperymentach wykorzystujemy transgeniczną linię myszy GFP-M, która znakuje komórki piramidalne warstwy 51. Komórki piramidalne warstwy 5 rzutują wypustki dendrytyczne do warstw powierzchownych, co umożliwia wizualizację dendrytów i kolców dendrytycznych do głębokości 300 μm poniżej poziomu opony twardej. Alternatywnym podejściem jest znakowanie komórek za pomocą markerów wirusowych (patrz Lowery et al., przesłane do JOVE).
- Zdezynfekuj przestrzeń roboczą 70% etanolem i wysterylizuj narzędzia w autoklawie w celu przeprowadzenia aptycznej operacji. Przykryj powierzchnię operacyjną czystym opatrunkiem.
- Zpodaj myszom koktajl Fentanylu (fentanyl 0,05 mg/kg; midazolam 5 mg/kg; metatomadin 0,5 mg/kg), a następnie ćwiartkę dawki Avertinu (0,075 mg/ml), zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez IACUC. Wstępnie podaj myszom lek przeciwbólowy, buprenorfinę (0,5 mg/kg), drogą podskórną (SQ). Monitoruj poziom znieczulenia, sprawdzając reakcję na uciśnięcie ogona/palca.
- Utrzymuj zwierzę w temperaturze 37,5°C, korzystając z mata grzewczego z przymocowanym termometrem rektalnym.
- Nałóż maść oftalmiczną na oczy, aby zapobiec ich wysuszeniu. Przykryj oczy małym kawałkiem papieru, aby chronić je przed źródłem światła podczas operacji.
- Za pomocą nożyczek usuń sierść z tyłu głowy (za uszami) aż do oczu.
- Oczyść górną część głowy zwierzęcia poprzez sekwencyjną aplikację 70% etanolu, a następnie szorowanie betadyną i zastosowanie roztworu betadyny.
- Wykonaj nacięcie w kształcie litery L za uszami i w górę wzdłuż prawej lub lewej strony linii środkowej (w zależności od tego, która półkula będzie obrazowana) aż do oczu. Odchyl skórę i odsuń ją od miejsca operacji. Nie usuwaj skóry, ponieważ zostanie ona zaszyta po sesji obrazowania.
- Używając precyzyjnej pęsety, delikatnie odciągnij skórę w górę i odsuń od obszaru zainteresowania.
- Delikatnie zeskrob okostnę z odsłoniętego obszaru czaszki za pomocą czystej pęsety lub ostrza mikrosurgicalnego. Używając patyczka higienicznego, nałóż niewielką ilość 10% chlorku żelaza na czaszkę, aby całkowicie wysuszyć błonę okostną i upewnić się, że została ona całkowicie usunięta. Ważne jest, aby czaszka była całkowicie sucha, co zapewni prawidłowe przyleganie kleju (patrz pkt 1). Używając pęsety lub ostrza mikrosurgicalnego, delikatnie zeskrob wysuszoną błonę okostną.
- Nałóż cienką warstwę kleju cyjanoakrylowego wokół okna obrazowania stalowej płytki głowowej (patrz Rycina 1) i przymocuj płytkę do czaszki.
- Używając drewnanego końca patyczka higienicznego, nałóż klej na wewnętrzne szwy okna obrazowania, upewniając się, że wszystkie szczeliny między płytką obrazującą a krzywizną czaszki są wypełnione.
- Wpuść kroplę akceleratora kleju do okna. Szybko usuń nadmiar akceleratora patyczkiem higienicznym lub chusteczką Kimwipe. Klej powinien być całkowicie utwardzony przed wierceniem.
- Zacznij ścieńczać czaszkę w oknie obrazowania, używając wiertła stomatologicznego z zamocowanym wiertłem stalowym o średnicy 0,7 mm. Przeplataj wiercenie okazjonalną aplikacją 0,9% jałowej soli fizjologicznej, aby uniknąć nadmiernego nagrzania czaszki.
- Wycieraj okno o wymiarach 4x4 mm na czaszce, wykonując krótkie ruchy w poprzek powierzchni czaszki wiertłem stomatologicznym. Sprawdź grubość czaszki za pomocą pęsety o tępym końcu. Powierzchnia czaszki powinna lekko uginać się pod delikatnym naciskiem. Optymalna grubość czaszki do obrazowania wynosi od 10 do 30 μm.
- Gdy czaszka będzie cienka, a okno oczyszczone ze wszystkich zanieczyszczeń, nałóż sól fizjologiczną na czaszkę. Sfotografuj okno obrazowania za pomocą cyfrowego aparatu zamontowanego na stereomikroskopie. Fotografia i wykorzystanie naczyń krwionośnych mózgu pomogą w zlokalizowaniu miejsca umieszczenia płytki obrazującej w kolejnych sesjach.
- Przenieś zwierzę do zestawu do mikroskopii dwufotonowej. Zwierzę powinno pozostawać na macie grzewczej (z sondą rektalną) przez całą sesję obrazowania. Uwaga: podczas sedacji temperatura wewnętrzna ciała zwierzęcia będzie znacznie wahać się w przypadku braku urządzenia grzewczego, co doprowadzi do uszkodzeń kory mózgowej lub potencjalnie do śmierci.
- Używany jest mikroskop dwufotonowy z laserem Mai Tai, pompką stanu stałego 10W dla maksymalnej mocy oraz zmodyfikowaną jednostką konfokalną Olympus Fluoview. System jest zoptymalizowany do obrazowania głębokich tkanek, a detektory zewnętrzne są zainstalowane jak najbliżej obiektywu, aby umożliwić maksymalną detekcję fluorescencji z mózgu. Stosowany jest obiektyw Olympus LUMPlan fl/IR 20X/0,95NA. Podczas obrazowania do zanurzenia obiektywu używana jest 0,9% sól fizjologiczna.
- Za pomocą tego mikroskopu, przy niskim cyfrowym powiększeniu (x1), zidentyfikuj obszar zawierający jasno znakowane neurony.
- Używając aparatu cyfrowego przymocowanego do okularu mikroskopu, wykonaj zdjęcie obszaru obrazowania. Alternatywnie, naszkicuj wzór unaczynienia krwi. Jest to konieczne, aby powrócić do tego samego miejsca obrazowania w późniejszym czasie.
- Uzyskaj stos obrazów przy niskim powiększeniu (obiektyw x20, 512x512 pikseli; krok 5 μm) przez cały widoczny zakres mózgu (zazwyczaj obejmujący ~20 μm), pokazujący zakres ramifikacji dendrytycznej. Uwaga: ten obraz przy niskim powiększeniu będzie służył do lokalizacji obszaru obrazowania w późniejszych punktach czasowych, ponieważ zarówno naczynia krwionośne, jak i dendryty zachowują swoją strukturę u zwierząt młodych i dorosłych.
- Używając oprogramowania do obrazowania (Fluoview, v. 5.0, FV30), zwiększ powiększenie cyfrowe 8-krotnie. W razie potrzeby dostosuj współrzędne X,Y (współrzędne panoramy) i zbierz stos obrazów o wysokim powiększeniu, który pokaże szczegółową morfologię dendrytyczną, w tym lokalizację i strukturę kolców dendrytycznych. Sporządź szczegółowe notatki dotyczące każdego zbieranego stosu, np. współrzędne panoramy, zakres zbierania, wielkość kroku z oraz liczbę kroków w stosie. Notatki te będą wykorzystywane przy powrocie do tego dendrytu lub aksonu w późniejszym czasie.
- Po obrazowaniu usuń płytkę głowową, delikatnie oddzielając ją od powierzchni czaszki. Używając pęsety, usuń resztki kleju pozostałe na czaszce i przemyj powierzchnię czaszki 0,9% jałową solą fizjologiczną. Zaszyj skórę nad czaszką, używając nici chirurgicznej nr 6. Przetrzyj obszar 70% etanolem. Aby złagodzić ból podczas rekonwalescencji pooperacyjnej, podaj 0,1 mg/kg buprenorfinę przeciwbólową, SQ.
- Umieść zwierzę w czystej klatce pod lampą grzewczą, aż się obudzi i odzyska sprawność ruchową. Przenieś zwierzę do oryginalnej klatki.
- Aby ponownie obrazować zwierzę w późniejszym czasie (nasze punkty czasowe mogą być oddalone od 2 dni do wielu miesięcy), usuń szwy lub ponownie otwórz skórę na głowie, stosując powyższe metody aseptyczne. Użyj cyfrowego obrazu unaczynienia mózgu (wykonanego w dniu pierwszej operacji), aby zlokalizować pierwotne miejsce obrazowania. Ponownie przymocuj stalową płytkę głowową (kroki 10-12). Użyj ostrza mikrosurgicalnego, aby delikatnie usunąć jakąkolwiek kość, która mogła odrosnąć między punktami czasowymi obrazowania. W razie potrzeby użyj wiertła stomatologicznego. Oczyść okno obrazowania zanieczyszczeń i nałóż kroplę 0,9% jałowej soli fizjologicznej.
- Przenieś zwierzę do mikroskopu dwufotonowego i zlokalizuj pierwotne pole obrazowania. W celu pomocy skorzystaj z fotografii cyfrowej wykonanej podczas pierwszej sesji obrazowania.
- Uruchom program Fluoview i otwórz oryginalny obraz przy niskim powiększeniu. Przyłóż arkusz przezroczystości do ekranu komputera i naszkicuj główny wzór naczyń krwionośnych za pomocą pisaka do folii.
- Otwórz obraz na żywo i dopasuj unaczynienie krwi do naszkicowanego wzoru na folii przezroczystej.
- Aby ponownie obrazować struktury powiększone 8-krotnie, otwórz wybrany stos zebrany podczas poprzedniej sesji obrazowania. Naszkicuj strukturę (np. aksonalną, dendrytyczną, glejową) na folii przezroczystej przyłożonej do ekranu komputera.
- Powiększ 8-krotnie obraz na żywo i ustaw współrzędne panoramy zgodnie z parametrami obrazowania z pierwszego dnia. W zależności od dokładności dopasowania lokalizacji przy niskim powiększeniu, może być konieczne również lekkie skorygowanie kąta obrazu. Po znalezieniu pożądanej struktury, dopasuj ją do naszkicowanego wzoru o wysokim powiększeniu. Zbierz stos z identyczną wielkością kroku i liczbą obrazów stosu z dla późniejszej analizy.
- Powtarzaj kroki 29 i 30, aż wszystkie obrazy o wysokim powiększeniu zostaną ponownie zebrane.
- Po zakończeniu obrazowania powtórz kroki 2-24. Ponowne obrazowanie może być powtarzane w maksymalnie dwóch oddzielnych punktach czasowych.
- Eksperymenty na zwierzętach były prowadzone zgodnie z wytycznymi i regulacjami ustanowionymi przez Vivarium oraz Division of Laboratory Animal Medicine w University of Rochester School of Medicine and Dentistry, w pełnej akredytacji Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, International (AAALAC) oraz są zgodne z prawem stanowym, ustawami federalnymi i polityką NIH.
Reprezentatywne wyniki
W myszach wykazujących ekspresję GFP-M podzbiór piramidowych komórek warstwy 5 oraz odpowiadające im wypustki dendrytyczne można łatwo zobrazować za pomocą dwufotonowej skaningowej mikroskopii laserowej (2PLSM)1. W niniejszej pracy zaprezentowaliśmy preparację z utonczoną czaszką, w której kość nad wybranym obszarem obrazowania zostaje utonczona do ~10-30 μm. Prawidłowo wykonany protokół pozwolił nam na wyraźną wizualizację dendrytów i kolców korowych w nienaruszonej korze wzrokowej w celu przeprowadzenia analizy ostrej lub przewlekłej (Rysunek 2).
Rysunek 1. Niestandardowa głowica i płyta podstawowa. (A) Widok z góry wykonanej na zamówienie płytki głowowej i podstawy użytych do przygotowania operacji cieńczenia czaszki. (B) Widok z boku wykonanej na zamówienie płytki głowowej i podstawy. (C,D) Szczegółowy schemat i obraz płytki głowowej.
Rycina 2. Reprezentatywne wyniki z 2PLSM po wykonaniu preparacji cienkiej czaszki. (A) Obrazowanie dendrytów in vivo w korze wzrokowej transgenicznej myszy GFP-M przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Obraz jest projekcją pojedynczego zdjęcia uzyskanego co 5 μm od opony miękkiej do końcowej głębokości 175 μmObramowany obszar w A przedstawia powiększony region w (B) i (C) obrazowany w dniu 0 (D0) oraz cztery dni później (D4). (D,E) Większe powiększenie odnogi dendrytycznej obramowanej w B i C, wykazujące kolce stabilne (białe groty strzałek), kolce utracone/cofające się (czerwone groty strzałek) oraz nowe kolce (zielone groty strzałek). Paski skali= A. 200 μm, B, C. 20 μm, D,E. 5 μm.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przewlekłe obrazowanie z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej staje się coraz popularniejszą techniką badania zmian morfologicznych wywoływanych podczas plastyczności2-5. W niniejszym materiale prezentujemy preparację z cienką czaszką, która pozwala na śledzenie zidentyfikowanych kolców dendrytycznych w nienaruszonym mózgu myszy w różne dni obrazowania. W tym protokole czaszka pozostaje nienaruszona, co powoduje minimalne uszkodzenia kory i skutkuje bardzo niskim poziomem neurostanu zapalnego, który mógłby ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez Burroughs Wellcome Career Award in the Biomedical Sciences (A.K.M), The Whitehall Foundation Research Grant (A.K.M), Sloan Foundation Fellowship (A.K.M), NIH EY019277 (A.K.M) oraz finansowany przez NEI Vision Training Grant, EY013319 (E.A.K.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Cytrynian fentanylu | Wewnętrzny | Koktajl z fentanylem: koktajl anestetyczny; Dawka IP: 0,0125 ml/g Końcowe stężenie koktajlu: 0,05 mg/kg | ||
| Chlorowodorek medetomidyny | Wewnętrzny | Koktajl z fentanylem: koktajl anestetyczny;Dawka IP: 0,0125 ml/g Końcowe stężenie koktajlu: 0,05 mg/kg | ||
| Midazolam HCl | Wewnątrzinstytucjonalnie | Koktajl z fentanylem: koktajl anestetyczny;Dawka domięśniowa: 0,0125 ml/g Końcowe stężenie koktajlu: 0,05 mg/kg | ||
| 2,2,2-tribromo–etanol | Koktajl Avertin: środek znieczulający; Dawka domięśniowa: 0,0075 cm³/g Końcowe stężenie koktajlu: 1% | |||
| 2-metylo-2-butanol (stężenie końcowe: 0,775%) | Koktajl Avertin: środek znieczulający; Dawka domięśniowa (IP): 0,0075 ml/g Końcowe stężenie koktajlu: 0,775% | |||
| System kontroli temperatury TC-1000 dla myszy | CWE, Inc. | Mysz TC-1000 | Regulacja temperatury ciała | |
| Toberadex | Własny (wykonany wewnętrznie) | Maść do oczu | ||
| 10% chlorek żelaza(III) | Ricca Chemical Company | 3120-32 | Przygotowanie z cieńszą czaszką | |
| Skalpel mikrochirurgiczny | Sable Industries | S-6400 | Przygotowanie preparatu z utcieńczoną czaszką | |
| Cyjanoakrylan 404,401 | Loctite | Nr kat. 46551 | Przygotowanie cienkiej czaszki | |
| Cyjanoakryl 401 | Loctite | Nr kat. 40140 | Przygotowanie metodą ścieńczenia czaszki | |
| Akcelerator kleju Zip Kicker | Technologia Pacer | PT-29 | Przygotowanie cienkiej czaszki | |
| Stalowe wiertła mikrochirurgiczne o średnicy końcówki 0,7 mm | Fine Science Tools | 19008-07 | Przygotowanie preparatu z cienkiej czaszki | |
| Sterownik momentu obrotowego Microtorque i końcówka Tech2000 | Ram Products, Inc. | TECH2000 WŁ./WYŁ. | Przygotowanie cienkiej czaszki | |
| szew jedwabny 6-0 (0,7 metryczne) | Ethicon Inc. | K8894H | Stożek C-1 | |
| Kleszczyki okularne, 10 cm, szerokość końcówki 0,5 mm, zakrzywione | Narzędzia chirurgiczne | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Nożyczki Bonn extra fine, 8,5 cm, końcówka prosta, ostrze tnące 13 mm | Narzędzia chirurgiczne | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Pinceta standardowa, prosta, końcówka 2,5 mm x 1,35 mm, 12 cm | Narzędzia chirurgiczne | Fine Science Tools | 11000-12 |
Bibliografia
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Holtmaat, A. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo. J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J Vis Exp. , (2008).
- Yang, G. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Xu, H. T. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
