Method Article

Przewlekłe obrazowanie kory wzrokowej myszy przy użyciu preparatu z rozrzedzoną czaszką

DOI:

10.3791/2060

⸱

October 25th, 2010

 , 
1Neurobiology and Anatomy, University of Rochester

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym filmie i materiale uzupełniającym pokazujemy protokół chronicznego obrazowania in vivo nienaruszonego mózgu przy użyciu preparatu z rozrzedzoną czaszką.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie in vivo za pomocą dwufotonowej laserowej mikroskopii skaningowej (2PLSM) pozwala na badanie żywych komórek i procesów neuronalnych w nienaruszonym mózgu. Przedstawiona tutaj technika pozwala na obrazowanie tego samego obszaru mózgu w kilku punktach czasowych (obrazowanie przewlekłe) z rozdzielczością mikroskopową pozwalającą na śledzenie kolców dendrytycznych, które są małymi strukturami reprezentującymi większość postsynaptycznych miejsc pobudzających w OUN. Zdolność do wyraźnego rozdzielenia drobnych struktur korowych w kilku punktach czasowych ma wiele zalet, szczególnie w badaniach plastyczności mózgu, w których zmiany morfologiczne w synapsach i przebudowa obwodów mogą pomóc wyjaśnić podstawowe mechanizmy. W tym filmie i materiale uzupełniającym pokazujemy protokół przewlekłego obrazowania in vivo nienaruszonego mózgu przy użyciu preparatu z rozrzedzoną czaszką. Preparat na rozrzedzoną czaszkę jest podejściem minimalnie inwazyjnym, które pozwala uniknąć potencjalnego uszkodzenia opony twardej i/lub kory, zmniejszając w ten sposób wystąpienie reakcji zapalnej. Gdy ten protokół jest wykonywany prawidłowo, możliwe jest wyraźne monitorowanie zmian w charakterystyce dendrytycznego kręgosłupa w nienaruszonym mózgu przez dłuższy czas.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aby uwidocznić neurony w nienaruszonym mózgu za pomocą mikroskopii dwufotonowej, stosuje się preparat, w którym neurony są znakowane markerami fluorescencyjnymi. W prezentowanych tutaj eksperymentach używamy transgenicznej linii myszy GFP-M, która oznacza warstwę 5 komórek piramidalnych1. Komórki piramidalne warstwy 5 rzutują procesy dendrytyczne na warstwy powierzchowne, umożliwiając wizualizację dendrytów i kolców dendrytycznych do głębokości 300 μm poniżej poziomu pia. Alternatywnym podejściem jest znakowanie komórek za pomocą markerów wirusowych (patrz Lowery i wsp., przesłane do JOVE).
  2. Wysterylizuj miejsce pracy przy użyciu 70% etanolu i....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie przewlekłe z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej staje się coraz popularniejszą techniką badania zmian morfologicznych wywołanych podczas plastyczności2-5. Tutaj demonstrujemy preparat z przerzedzoną czaszką, aby śledzić zidentyfikowane kolce dendrytyczne w nienaruszonym mózgu myszy w różnych dniach obrazowania. W tym protokole czaszka pozostaje nienaruszona, powodując minimalne uszkodzenie kory mózgowej i powodując bardzo niski poziom zapalenia nerwów, który może zmieniać funkcjonowanie mózgu.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Burroughs Wellcome Career Award w dziedzinie nauk biomedycznych (A.K.M), The Whitehall Foundation Research Grant (A.K.M), Sloan Foundation Fellowship (A.K.M), NIH EY019277 (A.K.M), oraz finansowany przez NEI, Vision Training Grant, EY013319 (E.A.K.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cytrynianw domuKoktajl fentanylowy: koktajl znieczulający;
IP Dawka: 0,0125 ml / g

Końcowa zawartość koktajlu: 0,05 mg / kg
medetominynyw domuKoktajl fentanylowy: Koktajl znieczulający;
IP Dawka: 0,0125 ml / g

Końcowa zawartość koktajlu: 0,05 mg / kg
Midazolam HCLW domuKoktajl fentanylowy: Koktajl znieczulający;
IP Dawka: 0,0125 ml/g

Końcowa zawartość koktajlu: 0,05 mg/kg
2,2,2-tribrom– tanol Koktajl Avertin: znieczulający;
IP Dawka: 0,0075 cc / g

Końcowa zawartość koktajlu: 1%
2-metylo-2-butanol (końcowe stężenie: 0,775%)Koktajl Avertin: znieczulający;
IP Dawka: 0,0075 cc / g

Końcowa konfiguracja koktajlu: .775%
TC-1000 Temp. System sterowania dla myszyCWE, Inc.TC-1000 Regulacjatemperatury ciała
ToberadexW domuMaść do oczu
10% chlorekRicca Chemical Company3120-32Preparat do cienkiej czaszki
OstrzeSable IndustriesS-6400Preparat do cienkiej czaszki
Cyjanoakrylan 404,401LoctiteP/N 46551Preparat do cienkiej czaszki
Cyjanoakrylan 401LoctiteP/N 40140Preparat do cienkiej czaszki
Zip Kicker Glue AcceleratorTechnologia PacerPT-29Preparat do cienkiej czaszki
Drill Steel Frezy o średnicyFine Science Tools19008-07Przygotowanie cienkiej czaszki
Skrzynka kontrolna mikromomentu obrotowego i rękojeśćTech2000Produkty Ram, Inc.TECH2000ON/OFFPreparat do cienkiej czaszki
#6-0 (0,7 metra) jedwabny szewEthicon Inc.K8894Hdo oczu Taper C-1
, 10 cm, szerokość końcówki 0,5 mm, zakrzywioneNarzędzia chirurgiczneFine Science Tools11152-10
Bardzo cienkie nożyczki do bonn, 8,5 cm, prosta końcówka, krawędź tnąca 13 mmNarzędzia chirurgiczneFine Science Tools14084-08
Kleszcze standardowe proste, końcówka 2,5 mm x 1,35 mm, 12 cmNarzędzia chirurgiczneNarzędzia do nauki o napięciu11000-12
fentanylu Chlorowodorek myszy żelaza mikrochirurgiczne Micro końcówki 0,7 mm Kleszcze opatrunkowe

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  2. Holtmaat, A. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Two Photon ImagingDendritic Spine ImagingThinned Skull PreparationChronic Brain ImagingMouse Visual CortexGFP Labeled NeuronsDendritic Spine MorphologyCortical Plasticity StudyIn Vivo MicroscopySkull Thinning Protocol

Related Articles